1.Structura Si Functiile Proteinelor.enzimele

  • Published on
    11-Jul-2015

  • View
    533

  • Download
    0

Embed Size (px)

Transcript

<ul><li><p>5/11/2018 1.Structura Si Functiile Proteinelor.enzimele</p><p> 1/34</p><p>r</p><p>CAPITOLUL IStructura ~ifunctiile proteinelor. Euzimele</p><p>Partea 1. ProteineleDin toti compusii organici proteinele au cea mai complexa structura si</p><p>prezi nta eel mal important component al materiei vii,Proteinele sunt heteropolimeri ai ce-aminoacizilor cu 0 rnasamoleculara</p><p>mare, Legindu-se intre ei prin Iegatura peptidica ~O~NH~, ei formeazalanturi polipeptidice, Legatura peptidica apare ca rezultat al reactiei dintregruparea carboxil a unui aminoacid ~igruparea amino a altuia. Reactia esteinsotita de eliminarea unei molecule de apa. La hidroliza totala a rnoleculeiproteice are loe ruperea legaturilor peptidice ~iobtinerea unui amestec deu-aminoaeizi.</p><p>Varietatea colosala de proteine 111natura este determinata de cornponentaam inoacida si de succesiunea am inoacizilor in catena polipeptidica. Pentrufiecare proteins este caracteristica 0 anurnita suceesi une a resturi lor deaminoacizi care ~ieste considerata ca structure primard a moleculei proteice,Lantul polipeptidic de regula se rasuceste 1 1 1 forma de spirals forrnandstructura secundara a moleculei proteice, Aceasta la rindul sau se rasucesteIntr-un mod complicat, dar strict specific, capatind 0 configuratie spatialanumita structura tertiara.Unele molecule proteice sunt formate din citeva lanturi polipeptidice, de</p><p>obicei perechi, identice sau diferite de structura primara, secundara si tertiara,care poartii denumirea de subunitati sau protom eri, E le formeaza un tip demolecule proteice cu proprietati fizico-chimice ~ibiologice specifice din punctde vedere structuralsi functional, Acest nivel de structure a rnoleculeiproteice poarta denumirea de structura cuaternard.Pentru mentinerea configuratiei spatiale, molecula proteid mai arenevoe de unele legaturi suplirnentare, Mal importante sunt legaturile dehidrogen, care apar Intre atomii de hidrogen ai gruparii ~NH- (sau ~H-)si atomii de oxigen ai gruparii ~O-, disulfidice (-S-S-) ~i ionice, careapar intre gruparile am ino eu sarcini pozitive ale acizilor diamino-monocarboxilici ~igruparile carboxil cu sarcini negative ale acizilormonoaminodicarboxilici,</p><p>8</p></li><li><p>5/11/2018 1.Structura Si Functiile Proteinelor.enzimele</p><p> 2/34</p><p>Structura rnoleculei proteice este foarte labila si se modifies user subactiunea factorilor tizici si chirnici. Ca rezu Itatal acestor actiuni se modifiesproprietatile fizice, chirnicesi biologice ale moleculei,Este necesar de a putea folosi cunosti nteie despre structura, propri etati Ie</p><p>f iz ice s i chirn ice ale proteinelor, functiile lor, componen ta p ro te ic a a o rg an e lo r~itesuturilor in norma si In diferite leziuni in vederea elucidarii functiilororganismului in n orma s i tu lb ur are a lo r In p ato lo gie ,TEMA 1</p><p>Importaota biochimiei pentru medicina,Aminoacizii. Reactiile de culoare ale proteinelor ~i aminoacizilorExperienta 1. Reactia de identificare a aminoacizilor ce contin</p><p>sulf legat slab (reactia Fol).Principiul metodel, La degradarea proteinelor si peptidelor sub</p><p>actiunea hidroxidului de sodiu din gruparile sulfhidril se elibereaza sulful subforma de sulfura de sodiu, care reactionind cu p lumb i tu l de sodiu, formeazaprecipitatul de sulfura de plumb (PbS) de culoare neagra sau b runa , Ecua ti areactiei:</p><p>1. CH1 - SHJCH~NHlICOOH</p><p>+2NaOHCH2-ORI</p><p>+t CH ~ NH2+ Na2S+H2JCOOH</p><p>Cisteina Serina</p><p>2. Na2S + Na2Pb02 + H20- PbS! +4NaOHJ .plumbit de precipitatsodiu negru</p><p>Metionina, spre deosebire de cisteina ~j cistina, nu da aceasta reactie,deoarece sulful in acest aminoacid este legat trainic.Mod de lucru. La 5 picaturi de ovalbumlna se adauga 5 picaturi de</p><p>reactiv Fol, Arnestecul se pune la fiert, Dupa 1~2 minute de fierbere apareun precipitat negru sau brun de sulfura de plumb (PbS).</p><p>9</p></li><li><p>5/11/2018 1.Structura Si Functiile Proteinelor.enzimele</p><p> 3/34</p><p>React ivul Folprezinta un ames-tee de volume egalede acetat de plumbde 5% J' i NaOH de30%.Exper ieuta 2.</p><p>Reactia de culoarepentru tirozina(reactia Millon).Prillci.piulmetodei, Reactivu IM illon la eald da cutirozina 0 coloratierosie. Reactia estecaracter ist ica am i~noacizilor care au 1 1 1structure un nucleufenolic,Mod de lueru.Intr-o epru beta seiau citeva cristale detiroziua la care seadauga acid sulfuricde 2,5%. Continutuleprubetei se agitapina la dizolvareacomplete a cristalelor, Se adauga I ml de reactiv Millon, se agita si se lasa latem peratura cam erei, Peste un tim p se observa aparitia unei coloratii roz-rosiatice sau a un u ip re cip ita t c aram iziu, Temp era tu ra r id ie ata fa ci litem aparitiacoloratiei.Reactivul Millon prezinta un amestec de mercur cu acid azoticconcentrat J i apa distilata tpuiin NaNO).Experienta 3. Reactia de culoare pentru arginilli'i iReacua Sakaguciy.Principiul metodei. A rginina, fiiud tratata cu a-naftal in prezentahipocloritului de sodiu sau hipobromitului de sodiu, da 0 coloratie rosiecaracteristica. Reactia este specifics gruparii guanidinice din structuraargin inei, La oxidarea de ruai departe a naftolargininei se form eaza un com pus</p><p>de tip ul c h in on im in ei,</p><p>OH OH</p><p>CH2IH C- NH2ICOOH</p><p>CH2IH ~C-NH2ICOOH</p><p>OH</p><p>CH2,H-C-~ICOOH</p><p>Derivat al o-ehinonoximei</p><p>10</p></li><li><p>5/11/2018 1.Structura Si Functiile Proteinelor.enzimele</p><p> 4/34</p><p>Der iva ti i ch inonim ine i (In c azu l d e fa lii n afto ch in on im i na ), la c are h id ro ge nu lgrupari iirn in ic e e ste s ub stitu it d e u n ra dic al a lc hi I s au a ril, intotdeauna sun t co lo ra ti1 1 1 n ua nte g alb en -ro sia tic e. C ulo are a ro sie -p orto ca lie a s olu tie i In c az ul r ea ctie iSak ag uc i s e exp lic a p ri n apa ri ti a d er iv at ul ui n af to ch in on im i ne i.Nl-hIC:::NH Br~H C Q 3NaB~ 6 y . I~ . (YI +2 . """ # yV(CH2 ) 3 BrI OH O-N-- -.. 0</p><p>I + H 20 + NaBr +C:::NH + 2NaOHI(CH2 ) 3ICH~NH2</p><p>CH-NHzICOOHArginina</p><p>M od de lucru . Intr-o eprubeta se iau 2 m l solutie de 0,01% de arginine lacare se adauga 2 m l solutie de hidrox id de sodiu de 10% ~iciteva p ica tu ri solut iealcoolica de a-nafto l de 0,2% . C ontinutul eprubetei se agita bine si se adauga0,5 m l solutie de hipobrornit de sodiu si iaras i se agita, lm ediat se adauga 1 m lso Iu tie de ure e de 4 0% p en tru stab IIiza rea co lora tie i ro s ii-po rto ca li iaparute.Experienta 4. Reacsia de culoare pentru histidinii (reactia Pauli).Principiul m etodei. La interactiunea aciduJui sulfanilic cu nitrit de</p><p>potasiu se produce reactia de diazotare si are lo c formarea aciduluid ia zo be nzen sul fou ic:</p><p>S03H SO)</p><p>+NH2 N-NAcid sulfanilic Acid diazobenzensulfonicIn reactia dintre histidina si ac iduJ d iazobenzensu lfon ic format s e o btin e 0</p><p>co lo ra tie rosie -visin ie :11</p></li><li><p>5/11/2018 1.Structura Si Functiile Proteinelor.enzimele</p><p> 5/34</p><p>Acid Histidinadiazobenzen-sulfonicAcid diazcbenzensulfonic</p><p>Mod de lucru, La 1 ml solutie de acid sulfanilic de 1% in solutie deacid clorhidric de 5% se adauga 2 ml solutio de nitrit de potasiu de 0,5%.Eprubeta se agita ~i se adauga 2 ml solulie de histidina de 0,01%. Dupaagitare se rnai a da uga 6 ml solutie de carbonat de sodiu de 10%. Apare 0coloratie rosie-visinie,Expe rreuta 5. Reactia de culoare pentru triptofan ireactia</p><p>A damkiew ick-Hopkins),Principiul metodei. Solutiile de triptofan fiind tratate cu acid glioxilic in</p><p>prezenta acidului sulfuric concentrat formeaza la nivelul zonei de contact uninel violaceu, Reactia este specifics inelului indolic.</p><p>COOH COOHI I ,CH - NH2 CH - NH2I ICH2 CH20 : J i + H - ? = O + 0 : J i </p><p>I COOH ITriptofan H Acid glicoxilic H</p><p>12</p></li><li><p>5/11/2018 1.Structura Si Functiile Proteinelor.enzimele</p><p> 6/34</p><p>COOH COOHI ICH - NH2 CH - NH2I ICH2 .. CH~~{~~N) COOH~N~I IH Produs de Hcondensare</p><p>Mod de lueru. La 5011 so lu ti e de triptafan de 0,5% se adauga 3 011deacid acetic glacial. Pe peretii eprubetei se introduc cu atentie 2-3 ml de acidsulfuric concentrat, astfel ca cele doua lichide sa se stratifice. La limita deseparatie dintre cele doua solutii va aparea un inel violaceu.Experienta 6. Reactia de euloare pent ru me ti ol li nt i (dupa Mack-Kartysi Sallivan).Principiul si modul de lucru. La 5 ml solutie de metionina de 0,02% seadauga prin agitare m al intai 1 m l s olu tie de hidroxid de sodiu de 14,3 N , apoi</p><p>0,3 m Isolutie proaspat pregatita de n itroprusid de sodi u de 0,I%. Amestec u I seincalzeste timp de 10 min pe baia de apii la temperatura de 35-40C. Apoieprubeta se raceste sub un jet de apa. rece timp de 2 minute si se adaugaprin agitare 5 ml de amestec de acid clorhidric si fosforic. Eprubeta se agitaI minutsi se raceste 10 minute. Apare a coloratie rosie-violeta,Experienta 7. Reactia tie culoare pentru glicinii ireactia Timermany.Principiul .,i modul de lueru. La 2 011solutie de glicina de 0,01 % la un</p><p>pH::: 8,0, obtinut prin adaugarea solutiei de 10% de hidroxid de sodiu, se adauga0,.5mlsolutie de dialdehida o-ftalica, Amestecul imediat se coloreaza in verde-aprins, Peste citeva minute apare un sediment de culoare verde.</p><p>Experienta 8. Reactia de culoare pentru prolinii.Principiul metodei, Ninhidrina interactioneaza ell aminoacidul prolina.</p><p>Produsul de eondensare are 0coloratie galben-deschisa:</p><p>13</p></li><li><p>5/11/2018 1.Structura Si Functiile Proteinelor.enzimele</p><p> 7/34</p><p>o</p><p>oo+HNQ</p><p>COOHNinhidrina Prolina</p><p>o '0 +CO,+H,Oo</p><p>Mod de Iucru, La 3 ml solutie de prolina de 0,01% se adauga citevapicaturi solutie de ninhidrina de 1%ln acetona de 95%. Continutul eprubetei seagita si se incalzeste pe baia de apa la temperatura de 70C timp de 5minute.</p><p>'Ierne pentru autopregattre1.Obiectu 1bioch imiei -?iimportan ta eiin med ieina practica. Metode Iede</p><p>s tud iu b ioch imice .2. Particularitatile materiei vii.3. Prcprietatile generate ale biornoleculelor.4. Rolul biologic a1proteinelor.5. Structura si clasificarea aminoacizilor; tipul de legatura in moleeula</p><p>proteica.6. Teoria polipeptidica a structurii proteinelor, esenta ei si dovezile</p><p>experimentale,7. Notareasi citireaarninoacizilor In peptide si proteine. Aminoacizii N</p><p>si C terminali.8. Principiul reactiilor de euloare ale proteineior si aminoacizilor.</p><p>14</p></li><li><p>5/11/2018 1.Structura Si Functiile Proteinelor.enzimele</p><p> 8/34</p><p>Intrebiiri pentru autocontrol ~i situatii de problema1 . Scrieti form u lele am inoacizilor care sunt deriv ati ai: a) acidului propi-</p><p>on I C ; b ) acid u lu i b utiric; c) acidu lu iv ale ria n ic . .2 . S crie ti fo nn ule le a m in oa ciz i lo r: a ) n ep ola ri h id ro fo bi; b ) n ep ola ri h id ro fili;</p><p>c) am inoacizilor en proprietati aeid e sl b azice.3 . S cr ie ti ~icititi tripeptidele: a) H is-Fen-Cis; b) T yr-Pro-A rg. Care din</p><p>reactiile de euloareefeetuate vor fi po zitiv e si eare n egativ e?4. Scrieti tetrapeptida la care am inoaeidul N -term inal sa fie prezentat</p><p>prin T rp, iar C vterm inal - prin M et. C ititi peptida scrisa,5. Scrieti eantitatea m axim a de tripeptide care pot f com puse din tre i</p><p>am inoaeizi indicati: G 1i,A la, Ser ~ ell conditia ea fieeare am inoaeid poate saoeupe orieare din cele trei pozitii : ; ; i e;'i fiecare arninoacid poate fi folositnurnai 0 singura data. (pentru scrierea peptidelor de folosit indicareaprescurtata a arninoacizilor - prin trei litere) , D e exem plu, G li-A la-Ser; Ser-G li~A la ; A la -A la -G li e tc .</p><p>6 . Se poate considers ca cornpusul eercetat es te 0 peptida, daca reactiacu ninhidrina este negativ e, iar reactia biuretica ~ p ozitiv a?7. Reactia F0I cu lich idul b iolo g ic este pozitiva, Se poate af nna di</p><p>su bstan ta este 0. proteina?8 . P u tem id en tifica p rezen ta am in oacizilo r liberi in so lu tie av in d la d isp ozi tie</p><p>nu rna ireacti v i pentru proba cu ninh id rina? M oti v ati raspunsu I.9. C um se poate stabil i i nehei erea h idro Iizei proteine iCll a j u t or u I r ea cti e i</p><p>biuretice? Ce euloare va aparea ~ipe baza carui cam pus?10. Ce m ediu se va crea la dizolvarea In ap a a u rm a to arelo r trip ep tid e:</p><p>a) A la-S er-C is; b) A rg -H is-L yz; c) G lu -C is-A sp ..S crieti g ru pele fu nction alea le r ad ic al j lor am inoacizi lor care determ ina pH - u 1m ed iu lui. in ce m ed iu sev a afla punctul izoelectric al aces tor peptide?1 1. A m estecul de glicina, alanina, acid glutam ic, lizina, arginina ~ i serinaa fost supus electroforezei In pH 6 ,0 . R asp un deti la u rrn atoarele intrebari sirnotivati raspunsul: Care din arninoacizi vor m igra spre eatod? Care spreanod? Care vor ram ine la locul de start?</p><p>12 . in ce directie va rnigra histid ine supusa electroforezei la folosireaso lu tiei tam p on ell d iferite v alo ri ale pll-ului: a) pH = 4,0. b) pH=12,0. Scrietifo rm lila a m i n oa eid I I I u isi m o tiv ati raspunsu I.</p><p>15</p></li><li><p>5/11/2018 1.Structura Si Functiile Proteinelor.enzimele</p><p> 9/34</p><p>13. Scrieti 0 tripeptide at care i punct izoelectric se vaafla in mediu alcal in.Motivati raspunsul,</p><p>14 . Sc ri et i 0 tr ip ep ti da (d e scris formulele aminoaeizilor) a l c are i p un ctizoelectric se va afla in mediu acid.</p><p>TEMA 2Structura chimica 'I,j rolul biologic al proteinelor</p><p>Experienta 1. Identificarea aminoacizilor prin metoda cromato-grafie! pe hirtie.</p><p>Principiul metodei. Metoda se bazeaza pe diferenta coeficientului derepartitie a aminoacizilor In apa si solvent organic (butanol), care nu searnesteca cu apa. Viteza migrarii aminoacizilor pe hirtie este directproportionala cu gradul de dizolvare in butanol.</p><p>Mod de lucru. Pe linia de start a henzii de hirtie cromatografica cuajutorul unui capilar se aplica 0picatura mica (diametrul nu mai mare de 5mm) de hidrolizat proteic sau amestec de arninoacizi. Dupa uscare la aer(fixare) banda se introduce in vasul el l amestecul de apa-butanol, astfel,incit lichidul sa ajunga numai pina la linia de start (2-3 mm). Cu ajutoruldopului, banda se fixeaza vertical rara sa se atinga de peretii vasuiui. Dupa1,5 ore de expunere la temperatura carnerei, banda se scoate din vas, senoteaza cu un creion simplu hotarul solventului si se usuca In termostat (10minute la temperatura de 70-IOOC). Apoi banda se trece prin solutie deninhidrina 0, 1-0,2% ~idin nou se usuca 1ntermostat latemperatura de 100C.Pe cromatograma apar unele pete galbene sau violete localizate la diferitedistante de linia de start. Cu ajutorul riglei se masoarii urrnatoarele distante:</p><p>I. De 1alinia de start ptna la centrul fiecarei pete (a);2. De la Iinia de start pina lahotarul solventului (b)..Raportul dintre.distanteleparcurse de aminoacid (a) ~ide solvent (b) poarta den urnirea de coeficient derepartitie (R), specific pentru fiecare aminoacid in conditii standard.</p><p>Importanta clinico-diagnostica. Metoda pennite detenn inarea calitativa~j cantitati va a aminoacizi lor in 0biectele biologics ceea ce are 0 importan tildeosebita in studierea rnetabolismului proteic. in diferite afectiuni ale ficatului,rinichilor ~ialtor organe se constata modificarea continutului aminoacizi lorin serul sanguin.</p><p>16</p></li><li><p>5/11/2018 1.Structura Si Functiile Proteinelor.enzimele</p><p> 10/34</p><p>Experienta 2. Reactia biureticii (Piotrovschiy.P rincipiul metodei. Legaturi Ie pept id ice (-NH-CO-) al e proteinelor 'in</p><p>mediu alcalin reactioneaza cu CuS04 fonnind cornpusi cornplecsi colorati Inro~u-vjolet.Mod de lucru, La 5 picaturi solutie de ovalburnina de 1% se adauga 5picaturi solutie d...</p></li></ul>