2.2 Espectroscopa de absorcin

  • Published on
    25-Jun-2015

  • View
    1.571

  • Download
    3

Transcript

2.2 Espectroscopa de absorcin en el visible y en el UV La absorcin que se lleva a cabo tanto en la regin visible como ultravioleta del espectro, depende de las transiciones electrnicas de la molcula, la cual al absorber energa del fotn, pasa a un estado excitado; este cambio se suele representar por: M+h M* .

Es conveniente considerar en espectroscopia UV-visible que la frecuencia de un haz de radiacin que incide en una sustancia permanece invariable y que dicha est determinada por la fuente emisora, por el contrario tanto la velocidad de radiacin y la longitud de onda dependen de la condicin del medio que atraviesa, un ejemplo de esto es que la velocidad de propagacin de la radiacin en el vaco o en el aire difieren muy poco y llega a alcanzar su valor mximo que es de 3 x 108 m/s siendo independiente.

Sin embargo en cualquier otro medio material, la velocidad de la radiacin disminuye a causa de la interaccin de la radiacin con la materia; en el caso de est decrece igualmente; para el vidrio que es el material ms utilizado como recipiente de una muestra en espectroscopia, la se acorta en casi 200 nm o ms.

2.2.1 Fundamento de la absorcin de radiacin visible por una muestra. Cuando un haz de radiacin incide sobre una sustancia transparente parte de esta energa es absorbida y el resto transmitida. Si la energa incidente tiene de la

regin visible que comprende de los 380- 700 nm y el medio a travs del cual tiene que pasar, absorbe selectivamente ciertas longitudes de onda, el color observado corresponder a las de la energa transmitida. Esto es, si una sustancia absorbe luz visible esta tendr color, el cual no es correspondiente a la luz que absorbe, existiendo una relacin inversa entre el color absorbido y el color observado. En la tabla No. 2.3 se muestra esta relacin: Color absorbido Violeta Verde-azulado Azul-verdoso Amarillo Rojo-naranja Rojo o prpura Longitud de onda 560-580 595-610 610-750 400-435 490-500 500-560 Color observado Amarillo verdoso Naranja Rojo Violeta Azul verdoso Verde-azul

El color de la luz absorbida es complementario del color de la propia solucin por ejemplo; una disolucin que contiene protenas presenta el color violeta al utilizar el reactivo de Biuret para su identificacin, aparece de ese color porque transmite el color violeta del espectro pero absorbe el color amarillo; por lo que se debe

utilizar en el caso de un fotmetro un filtro color amarillo y en el caso de utilizar un espectrofotmetro se debe hacer considerar una que vaya de los 400-435 nm

para llevar a cabo el anlisis de protenas colorimtricamente.

2.2.2 Caractersticas generales de los instrumentos utilizados para espectroscopia de absorcin en el visible en el laboratorio. En la actualidad se cuenta con equipos muy completos para poder llevar a cabo tcnicas espectroscpicas basadas en los fenmenos de emisin, absorcin, fluorescencia o dispersin de la luz con altos lmites de confianza. Las compaas como Bausch and Lomb, Varian, Perkin Elmer y Hewlett Packard se han dedicado por aos al diseo, construccin y operacin de estos equipos cuyas caractersticas de los instrumentos usados en la espectrofotometra e absorcin de la regin visible as como los diferentes tipos se mencionan a continuacin: Fuente de radiacin. Las mediciones por encima de los 350 nm, se suelen llevar a cabo con lmparas de filamento incandescente, por lo general de tugsteno que suministra suficiente energa radiante en la regin de donde se va a medir la

absorcin, adems de mantener de forma constante una intensidad de luz durante todo el tiempo que transcurra durante el anlisis. Estas lmparas son econmicas con excelente estabilidad; una lmpara especial es la de tugsteno-halgeno que es suficientemente brillante para los trabajos en la regin visible-UV. Monocromadores. Son dispositivos que permiten utilizar cierta regin de , su funcin principal consiste en proporcionar una energa radiante con valores muy

estrechos de con una banda espectral reducida por lo que facilitan seleccionar la con la que se va a trabajar como se muestra en la figura No. 2.5.

Los monocromadores como el de Ebert o de Littrow cuentan con una rendija de entrada que proporciona una imagen ptima del haz de luz proveniente de la lmpara, un espejo cncavo colimador que produce el paralelismo de la luz entre la rendija de entrada y de salida con ayuda de un prisma reflejante o rejilla, produciendo como efecto una banda espectral deseada.

Celda o cubeta. Se trata de recipientes que van a contener la muestra por lo general lquida; su funcin adems de la anterior consiste en transmitir la energa radiante en la que nos interesa; las celdas de vidrio son apropiadas para la regin visible, las de cuarzo o con alto contenido en slice se usan en UV, mientras que las de algunas sales como el KCl son empleadas en espectroscopia IR.

Las celdas son dispositivos importantes de la instrumentacin, algunas de ellas tienen 1 cm de paso de luz, pero pueden presentar caminos pticos de fracciones de milmetro o hasta 10 cm o an ms. Por ello la celda debe estar debidamente certificada y deben ser llenadas de tal forma que el haz de luz pase a travs de la solucin. Tambin es necesario asegurarse de la posicin de la misma en el compartimiento del instrumento al igual que su limpieza para evitar interferencias.

Detector. Son detectores fotoelctricos el ms sencillo es un fototubo; estos tubos estn construidos al vacio, en su interior estn conectados un par de electrodos como se muestra en la figura No. 2.6, en los que se mantiene un potencial y que asoman a travs de una ventana que permite la entrada de la radiacin transmitida. La superficie del electrodo negativo es fotosensible; esto quiere decir que, cuando el electrodo se irradia con los fotones provenientes de la luz, los electrones son expulsados a la superficie llegando a travs de un diferencial de potencial al electrodo positivo y estableciendo una corriente en el circuito, la cual es medida como % de transmitancia o Absorbancia.

Las caractersticas que se desean encontrar en un detector son: sensibilidad elevada en la regin espectral, respuesta lineal, tiempo de respuesta rpida, bajo nivel de ruido. Sin embargo estos factores se deben de evaluar en la prctica. (Day, 1989).

Amplificacin y lectura. Ya que el detector percibe el haz de radiacin proveniente de la muestra, cualquier cambio en la intensidad de radiacin debido a la absorcin, se detecta como seal. Esta seal amplificada del detector se utiliza para situar a un atenuador ptico, de modo que la radiacin del haz de la muestra se conserve a la misma intensidad.

La proporcin de atenuacin requerida constituye una lectura directa de la absorcin por parte de la muestra.

2.2.2.1 Colormetro o fotocolormetros

El colormetro Spectronic 20 de Bausch and Lomb (ver fig. No. 2.7) es considerado como un espectrofotmetro de un solo haz de gran popularidad, estos fotocolormetros son el tipo ms simple de espectrofotmetros de absorcin basado en la operacin de un solo haz, en que la muestra se examina para determinar la cantidad de luz absorbida a cierta .

Los resultados se comparan con una solucin de referencia (por lo general un disolvente puro como lo es el agua destilada), con la que se lleva a cabo una medicin por separado. Los cambios de intensidad de la fuente y de sensibilidad del detector limitan a los instrumentos de un solo haz a mediciones con una seleccionada por un filtro aplicable a sistemas absorbentes con bandas de absorcin anchas.

Para utilizar un colormetro es necesario conocer el mximo de absorcin de la sustancia analizada. La se fija manualmente y despus la solucin de referencia

se coloca en la trayectoria de la luz y se ajusta el instrumento para que de una lectura de 0% de Transmitancia cuando se cierra el obturador y no pasa luz al detector y de 100% cuando se abre el obturador.

Despus de llevar a cabo estos ajustes (se dice de forma equivocada calibrar el equipo a 0% de absorbancia y 100% de transmitancia), se coloca la muestra en la trayectoria de la luz y se lee la absorbancia que se relaciona con la concentracin, ya sea por medio del uso de una curva de calibracin o de mtodos algebraicos apropiados.(Willard,1986)

Uno de los requerimientos de los instrumentos de un solo haz es un alto grado de estabilidad tanto de la fuente de luz como del detector, ya que las fluctuaciones causan lecturas errneas. En la fig. No. 2.8 se muestra un fotmetro de filtro de un solo haz de lectura directa. El trayecto ptico va simplemente de la fuente de luz a travs del filtro y de la porta muestra al detector.