5. Microscopía. Tinciones bacterianas

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    30-Jul-2015

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<p>5 - MICROSCOPA . TINCIONES BACTERIANAS</p> <p>47</p> <p>5. MICROSCOPA. TINCIONES BACTERIANAS 5.1. INTRODUCCIN La microbiologa se ha podido desarrollar a partir de la aparicin y progreso del microscopio, gracias al cual se pueden visualizar las bacterias. El ojo humano no es capaz de discriminar ms all de 0,1 mm. El microscopio ptico tiene como lmite de poder de resolucin unos 0,20 microns. Estn a su alcance estructuras celulares como cromosomas, nucleolos, cloroplastos, mitocondrias. El microscopio electrnico, que tiene un poder de resolucin del orden de 4 Angstrom (C), es capaz de visualizar la estructura de las membranas, ribosomas, etc. 5.2. EL MICROSCOPIO PTICO En microscopa nos podemos encontrar un microscopio simple, que no es ms que una lente biconvexa o un microscopio compuesto, que emplea dos sistemas de lentes separadas, consiguiendo con ello mayores aumentos. Todo microscopio compuesto constar de: Un sistema ptico que aumenta la imagen. Un sistema de visualizacin que amplifica adecuadamente dicha imagen. 5.2.1. Contraste. Absorcin diferencial de la luz entre la muestra y el medio. El grado de contraste se puede mejorar, aumentndolo mediante tcnicas de tincin. 5.2.2. Amplificacin. La amplificacin de la imagen en un microscopio se obtiene mediante dos sistemas de lentes: Un primer sistema de lentes situado ms cerca de la muestra, el objetivo que aumenta la imagen real. El segundo sistema de lentes, que se sita ms alejado de la muestra y ms prximo al ojo humano, es la lente ocular, que se encargar de ampliar esa imagen real originando una imagen virtual que es la que percibe el ojo humano. Los microscopios en la mayora de laboratorios de microbiologa presentan los objetivos siguientes: objetivos secos, de x4, x10, x40 objetivos de inmersin, x100 aumentos. La amplificacin total de un microscopio ptico se obtiene multiplicando la ampliacin del objetivo, por la ampliacin del ocular.</p> <p>5 - MICROSCOPA . TINCIONES BACTERIANAS</p> <p>48</p> <p>5.2.3 Poder de resolucin. El poder de resolucin de una lente es la capacidad que sta presenta para poder observar dos puntos adyacentes como distintos y separados.El poder de resolucin en un microscopio est en funcin de la longitud de onda () de la luz empleada y de las caractersticas del sistema de lentes, llamado apertura numrica.</p> <p>Fig. 5.1 El lmite o poder de resolucin de un microscopio (d) es la distancia mnima entre dos puntos que permite distinguirlos uno de otro. Se expresa como: d = 0,5 / N sen = longitud de onda de la luz empleada Nsen = apertura numrica (medida del tamao del cono de luz refractada por la preparacin que admite el objetivo) N, es el ndice de refraccin del medio (aire/aceite de inmersin) que hay entre la muestra y la lente del objetivo , es la mitad del ngulo que forma el cono de la lente del objetivo.</p> <p>5 - MICROSCOPA . TINCIONES BACTERIANAS</p> <p>49</p> <p>Cuanto ms pequeo sea el poder de resolucin de un microscopio, ms capacidad de amplificacin tendr. Esto se consigue aumentando la apertura numrica (para microscopio ptico, 1,25 es un valor normal de apertura numrica, 1,4 es un valor mximo). La apertura numrica depende del ndice de refraccin del medio que hay entre la muestra y el objetivo. Como que el ndice de refraccin del aire es menor que el del vidrio, los rayos luminosos se refractan cuando pasan del portaobjetos al aire. La mayora de los rayos luminosos que han atravesado la muestra se desvan en un ngulo tan grande que se pierden. El aceite de inmersin (N = 1,56) tiene, aproximadamente, el mismo ndice de refraccin que el vidrio. Si ponemos una gota de aceite entre la preparacin y el objetivo, la mayora de los rayos luminosos procedentes de la muestra pasan directamente al objetivo, aumentando la resolucin del microscopio y observndose una imagen ms clara. (Naire = 1) No se ha de utilizar nunca aceite de inmersin con objetivos secos. La distancia a la muestra es mayor y los rayos refractados son recogidos por estas lentes. La resolucin podra aumentarse tambin, disminuyendo la longitud de onda de la luz, empleando luz ultravioleta. En este caso al no ser nuestro ojo sensible a tales radiaciones, la observacin no puede ser vista y es necesario utilizar una placa fotogrfica, adems comporta tambin utilizar lentes de cuarzo y modificar la parte ptica del microscopio. Sin embargo el microscopio ptico debido a la misma naturaleza de la luz y de su longitud de onda no puede superar un cierto poder de resolucin. El lmite de resolucin con onda corta ( = 426 nm) es de 200 nm = 0,2 . Al utilizar en el microscopio electrnico haces de electrones de longitud de onda corta se consiguen mayores resoluciones con lo que se supera el problema resolutivo del microscopio ptico pasando de 2.000 C a 5 C, adems consigue un mayor poder amplificador. 5.2.4. Estructura de un microscopio Un microscopio se divide en dos partes, el soporte y el sistema ptico. I. Soporte. En los modelos modernos el soporte es una pieza fija en la que nicamente la platina y el condensador tienen un cierto movimiento. Las partes principales son: a) La base, que normalmente alberga la fuente de iluminacin (lmpara incandescente halgena). En determinados modelos la base incorpora adems un sistema portafiltros con varios filtros y un diafragma de campo luminoso. b) El brazo soporta todo el sistema ptico, el cabezal portaoculares (mono o binocular) y el revlver portaobjetivos. En el brazo se dispone tambin el mecanismo de anclaje de la platina dotado del correspondiente sistema de enfocado de la preparacin. c) La platina es la pieza donde se coloca la preparacin microscpica para su observacin. Presenta un orificio central por donde pasa la luz y est equipada con un sistema de fijacin de la preparacin y de desplazamiento en cruz, lo que permite posicionar cmodamente la zona de la preparacin que hay que observar. En su parte inferior se dispone el sistema de fijacin del condensador.</p> <p>5 - MICROSCOPA . TINCIONES BACTERIANAS</p> <p>50</p> <p>d) El macromtrico y el micromtrico permiten enfocar la preparacin. El primero se emplea para un enfoque rpido cuando se trabaja con el objetivo de menor aumento (x10), mientras que el micromtrico permite afinar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de mayor aumento (x40, x100).</p> <p>Fig. 5.2 II. Sistema ptico. El Sistema ptico est formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto. Como se indica ms adelante, tanto oculares como objetivos no son lentes simples, sino conjuntos que funcionan como una nica lente que aumenta considerablemente la calidad de la imagen. Un microscopio convencional posee tres sistemas de lentes: a) El condensador, colocado entre la fuente de luz y la preparacin. Concentra los rayos de luz en un punto o foco, que, para una observacin ptima, debe hacerse coincidir con el plano de la muestra. Incorpora tambin un diafragma tipo iris que permite ajustar la cantidad de luz que llega a la preparacin y acta de un modo muy eficaz sobre el contrastado de la preparacin (mayores aumentos requieren ms iluminacin, es decir, mayor apertura del diafragma).</p> <p>5 - MICROSCOPA . TINCIONES BACTERIANAS</p> <p>51</p> <p>b) Los objetivos proporcionan una imagen ampliada de proyeccin real e invertida que se forma en el plano focal anterior del ocular. Los objetivos estn montados sobre un dispositivo portaobjetos giratorio de revlver. En bacteriologa se hace uso frecuentemente del objetivo de inmersin (normalmente de 100 aumentos), que acostumbra presentar grabada una raya negra o la inscripcin Inm. Este objetivo debe ser empleado incluyendo entre l y la preparacin aceite de inmersin para microscopa. c) El ocular aumenta a modo de lupa la imagen real proyectada por el objetivo y permite que sea percibida por el ojo. Lleva grabado el nmero de aumentos. Para evitar los defectos pticos de tipo aberracin cromtica1 y esfrica2 inherentes a las lentes nicas, tanto el ocular como los objetivos estn formados por sistemas o conjuntos de lentes cuyo diseo reduce al mximo estos defectos. La disposicin correcta del condensador es de gran importancia a la hora de obtener una imagen clara y contrastada. Cuando se emplean grandes aumentos, es fundamental conseguir una iluminacin ptima; en este caso es necesario realizar un centrado tanto de la fuente de la luz como del condensador, adems de un correcto diafragmado. Informacin objetivos Longitud del tubo: Distancia que media entre la superficie de conexin del objetivo en el revolver y el extremo del tubo en el cual se introduce el ocular. Nmero de campo: Dimetro en nanmetros (nm) del campo de visin que puede ser observado a travs del ocular. Distancia de trabajo: Es el espacio entre la lente frontal del objetivo y la superficie superior del cubreobjetos, cuando est enfocada la imagen de una muestra. A mayor aumento de objetivo, menor distancia de trabajo. Los distintos aumentos que podemos encontrar en los objetivos estn codificados por un anillo de color de la siguiente forma: 1 x negro 2 x castao 4 x, 5 x rojo 10 x amarillo 20 x verde 40 x, 50 x azul claro 60 x azul cobalto 100 x blanco</p> <p>Los objetivos de inmersin en aceite llevan una marca de identificacin que es un anillo negro.</p> <p>1</p> <p>aberracin cromtica. Se producen irisaciones (anillos coloreados) en torno a los objetos que estn en el campo del microscopio.2</p> <p>aberracin esfrica. No logran enfocar simultneamente todo el campo del microscopio, lo que produce imgenes borrosas.</p> <p>5 - MICROSCOPA . TINCIONES BACTERIANAS</p> <p>52</p> <p>Fig. 5.3</p> <p>Nomenclatura de los objetivos</p> <p>5.2.5. Manejo y uso del microscopio 1. Compruebe que las lentes del ocular y los objetivos estn limpias. De no ser as, limpiarlas con papel de fumar. Si el objetivo estuviera muy sucio, se puede humedecer el papel con un poco de alcohol. No tocar las lentes con los dedos. 2. Coloque la preparacin sobre la pletina sujetndola con el dispositivo mvil. Compruebe previamente que el objetivo de menor aumento est en posicin de empleo. 3. Para bacteriologa, ilumine la preparacin bajando casi totalmente el condensador, con el diafragma abierto totalmente. 4. Coloque el objetivo de 10 aumentos (x10) y enfoque: a. Acerque al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando para ello el macromtrico. No haga esta operacin mirando por el ocular, pues correra el riesgo de "clavar" el objetivo en la preparacin con el consiguiente destrozo de ambos. b. Suba el tubo lentamente con el macromtrico observando por el ocular hasta que obtenga un enfoque ntido. 5. Pase al objetivo de 40 aumentos (x40). suba ligeramente el condensador. La imagen debe de estar casi enfocada; afine el enfoque con el micromtrico. Si la imagen no est ni medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo x10. 6. Empleo del objetivo de inmersin</p> <p>a. Gire el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el objetivo de x40. b. Coloque una gota mnima de aceite de inmersin sobre el punto de luz. c. Termine de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objeto de inmersin, asegurndose de que ste no toca la preparacin, pero s la gota de aceite. d. Enfoque cuidadosamente con el micromtrico. La preparacin debera estar prcticamente enfocada si se ha realizado un enfoque cuidadoso con el objetivo de x40. De no ser as, es preferible volver a enfocar de nuevo un campo distinto partiendo del objetivo de x10. Recuerde que la distancia de trabajo desde la lente frontal del objetivo de inmersin a la preparacin es mnima, por lo que el riesgo de accidente es ahora mximo. e. Una vez que haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no puede volver a colocar el objetivo de x40 sobre ese campo, pues correra el riesgo de mancharlo de aceite.</p> <p>5 - MICROSCOPA . TINCIONES BACTERIANAS</p> <p>53</p> <p>f. Finalizada la observacin de una preparacin y antes de retirarla de la platina, se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver en el sentido hacia la lupa. Nunca retirar la preparacin con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. g. Retire la preparacin y limpie el objetivo de inmersin cuidadosamente empleando papel de fumar. Compruebe tambin que el objetivo de x40 est perfectamente limpio. h. Limpiar los portas con solucin jabonosa. Aclararlos abundantemente y dejarlos guardados en un recipiente cerrado con disolucin eter-alcohol 1:1. i. Limpiar con rapidez cualquier suciedad que caiga en el microscopio. j. Guardar el microscopio con el revolver en posicin "sin objetivo" o con el objetivo de menor aumento. Recoger los cables elctricos y colocar en el armario segn las normas indicadas. k. Para desplazar el microscopio, sujetar la columna con una mano y el pie con la otra. l. No forzar los engranajes que mueven la pletina. 5.3. TIPOS DE MICROSCOPA PTICA En general, para el trabajo diario, el instrumento de uso ms comn es el microscopio de campo luminoso (microscopio ptico). Los otros tipos son utilizados con fines especiales o trabajos de investigacin. A. Microscopa de campo luminoso (microscopio ptico). Esta basada en los principios expuestos en los apartados anteriores. B. Microscopa de campo oscuro. Es un microscopio ptico donde aparecer un efecto producido por la tcnica del campo oscuro, que consiste en un fondo negro sobre el cual se ven los objetos intensamente iluminados. Esto se obtiene al equipar al microscopio con un condensador especial que dirige la luz desde la fuente luminosa por una trayectoria tal que slo los haces de luz que tropiezan con los objetos de la muestra se dirigen al objetivo. C. Microscopa de luz ultravioleta. El microscopio de luz ultravioleta permite un poder de resolucin mejor, ya que la luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 180 a 400 nm frente a la de 400 a 700 nm del espectro visible. las imgenes del microscopio ultravioleta pueden ser visualizadas por el ojo humano gracias a un tubo convertidor de imagen que se registrar sobre un plano fotogrfico o televisin sensible a la luz ultravioleta. D. Microscopa de fluorescencia. Existen sustancias en la naturaleza que son capaces de absorber la energa de las ondas ultravioletas y emitirla como ondas visibles de mayor longitud de onda. De ah que existan materiales que a la luz ordinaria presentan un color y a la luz ultravioleta otro distinto y ms intenso. Este tipo de materiales se denominan fluorescentes. Basndose en esta propiedad, la microscopa de fluorescencia consistir en teir previamente el microorganismo con un colorante fluorescente y observarlo al microscopio con luz ultravioleta. E. Microscopa de contraste de fases. Es uno de los mejores mtodos para la visualizacin de microorganismos vivos. Las preparaciones de la muestra se iluminan de manera controlada mediante objetivos especiales de contraste de fase de la luz, con lo que se puede distinguir ndices de refraccin similares. Establecer un contraste de fase hace diferenciar estructuras que tienen ndice de refraccin muy prximo, las cuales no se apreciaran con el microscopio convencional. Se recurre a un di...</p>