Analisi Molecolare Dei Geni

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    La possibilita di conoscere i genideriva dalla capacitadi manipolarli:

    -isolare un gene (enzimi di restrizione)

    -clonaggio (amplificazione) vettori

    -sequenziamento

    -funzione

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    Il gene o la sequenza genica isolata deve

    essere inserita allinterno di un vettore chepermette lamplificazione (aumento delnumero di copie) della sequenza stessa, inmodo che il gene diventi manipolabile

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    COSTRUZIONE DI VETTORI DI

    CLONAGGIO

    - Plasmidi (fino a 10kb)

    - Vettori fagici (fino a 15 Kb)- Vettori cosmidici (fino a 45 Kb)

    - BAC (basati sul fattore F di E.Coli, insertofino a 300 Kb)

    - PAC (basati sul genoma fagico P1, fino a

    120 Kb)- YAC cromosomi artificiali di lievito (inserto

    fino a 2 Mb)

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    Proprieta di un vettore di clonaggio

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    Vettore despressione

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    Vettori

    fagicie cosmidi

    Alta afficienzadi infezione e quindidi trasferimento delgene clonato

    allinternodella cellula batterica

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    YAC, cromosomi artificiali di lievito o minicromosomi,inseriti nelle cellule attraverso microiniezione o liposomi,ospitano fino a

    500 Kb di DNA

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    BACcromosomibatterici

    artificiali

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    Genotecao libreriagenomica

    -amplificare frammentio geni

    -identificare geni

    -determinare nuovi geni-contiene geni nellaloro forma nativa consequenze regolative ed

    introni-ogni vettore porta unpezzo del genoma, etutti i vettori insieme

    rappresentano tutto ilgenoma

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    Genoteca di c-DNA:genoteca di sequenze

    espresse

    -ogni vettore portaun c-DNA, quindiun trascritto genico,

    e tutti i vettoriinsiemerappresentano tuttoil trascrittoma

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    Caso 1. Si conosce la funzione del gene ma non

    la sequenza genica ne la proteina

    IDENTIFICAZIONE DEI CLONI PERCOMPLEMENTAZIONE

    La complementazione funzionale ilprocesso mediante il quale una particolaresequenza di DNA in grado di compensare

    la mancanza di una funzione in una cellulamutante, ripristinando cos il fenotipoWild-type.

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    Yeast to human: rescue

    CDK=chinasi

    ciclinadipendente

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    Poiche conosco le sequenze a monte e a valle del pezzo digenoma clonato, mi posso costruire dei primers che

    permettono di amplificre e sequenziare linserto

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    Caso 2: se e nota la sequenza delgene posso costruire una sonda diDNA / RNA che andra ad ibridare con

    la sequenza genica

    Caso 3: non conosco la sequenzagenica ma conosco la sequenzaaminoacidica anche qui

    costruisco una sonda a DNA/RNA,tenendo conto della degenerazione del

    codice genetico

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    SAGGI DI IBRIDAZIONESTANDARD E SAGGI INVERSI

    STANDARDCOLONY-BLOT

    SOUTHERN BLOT

    NORTHERN BLOTIBRIDAZIONE IN SITU SU TESSUTO O CROMOSOMI

    INVERSI (MARCATURA DEL TARGET)MICROARRAY DI DNAMICROARRAY DI OLIGONUCLEOTIDI

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    LIMPIEGO DI SONDE BASATE SU ACIDI NUCLEICI E

    UNO STRUMENTO FONDAMENTALE PER LA GENETICAMOLECOLARE

    SI SFRUTTA LA CAPACITA DELLE MOLECOLE DIACIDO NUCLEICO A SINGOLO FILAMENTO DI

    FORMARE MOLECOLE A DOPPIO FILAMENTO

    IBRIDAZIONE

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    I SAGGI PIU COMUNI DI IBRIDAZIONE PREVEDONO LUSO DISONDE

    SONDE:MOLECOLE DI ACIDO NUCLEICO A SINGOLO O DOPPIOFILAMENTO MARCATE

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    sequenza di DNA genomico o di c-DNA

    Sonda (probe) marcata di 15-100 nt

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    - PER INDIVIDUARE LA PRESENZA DEL GENE CHE SI STA

    CERCANDO

    - PER OSSERVARE LA PRESENZA DI UN TRANSGENE INSERITO NEI

    CROMOSOMI (PRESENZA O ASSENZA)

    - PER OSSERVARE TRASLOCAZIONI CROMOSOMICHE

    - PER OSSERVARE LE DIMENSIONI DEL TARGET (NON OSSERVABILI

    CON ALTRE TECNICHE)

    - PER OSSERVARE LA COLLOCAZIONE SUBCROMOSOMICA O NEL

    TESSUTO O NELLA CELLULA DEL TARGET

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    COLONY-BLOT

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    Chromosome walkingIl risultato dello screening di una libreria di cDNA ma,

    specialmente di una libreria genomica quasi sempre

    un clone che non comprende lintero gene. Per isolare ilgene intero si utilizza una tecnica chiamata chromosomewalking. Questa tecnica presuppone che la libreria siaformata da cloni parzialmente sovrapposti tra loro. Latecnica consiste nellutilizzare il cDNA isolato comesonda con cui si sonda una nuova libreria (di solitogenomica) Il risultato di questo screening dovrebbe daredei nuovi cloni una parte dei quali si estenderulteriormente verso il 5, il 3 o entrambe le direzioni. I

    cloni pi esterni saranno nuovamente utilizzati comesonde per isolare nuovi cloni che si estendono al 5 o al3 ecos via fino ad isolare lintero gene.

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    La reazione di amplificazione del

    DNA o PCR

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