aula pratica FERMENTAÇAO 2011

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    02-Jul-2015

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<p>TECNOLOGIADAFERMENTAO Boas Prticas de Laboratrio (BPL) Good Laboratory Practice (GLP)</p> <p>TODAS as prticas devem ser realizadas utilizando as BPL. Como qualquer outra atividade de laboratrio, todas as investigaes exigem que o usurio adote as BPL. Aqui so dadas notas resumidas para auxiliar os envolvidos nas vrias atividades prticas a conduzi-las de forma segura. Lembre que antes de realizar qualquer atividade prtica, uma avaliao de risco deve ser realizada para garantir mnimo perigo para todos envolvidos. Se existir qualquer dvida sobre a avaliao de riscos, consultar o professor ou instrutor. Microbiologia segura</p> <p>As atividades prticas selecionadas e os microrganismos sugeridos apresentam risco mnimo quando seguida as BPL. Portanto, essencial observar as BPL em microbiologia quando trabalhar com qualquer tipo de microrganismo. Existem cinco reas essenciais que devem ser consideradas para trabalhar com investigaes prticas em microbiolgicas: </p> <p>Preparo e esterilizao de equipamentos e meios de cultura. Preparo da cultura microbiolgica como cultura estoque para investigaes posteriores e inculo para a presente investigao. Inocular no meio a cultura preparada Incubao das culturas e amostragem durante o crescimento Esterilizao e descarte seguro de descontaminao de dos equipamentos todas as culturas e</p> <p>Habilidade de boa organizao e conduta disciplinada pode assegurar que toda atividade realizada de forma segura e com sucesso.</p> <p>Proteo Alimento ou bebida no deve ser armazenado ou consumido em um laboratrio de microbiologia. As mos devem ser lavadas com sabo</p> <p>desinfetante depois de manejar culturas microbiolgicas e sempre que sair do laboratrio. Para garantir que qualquer ferida, corte ou arranhes no sejam infectados ou sejam fonte de contaminao, proteg-los com material a prova de gua ou usar luvas cirrgicas descartveis. Habilidade de boa organizao e conduta disciplinada pode assegurar que toda atividade realizada de forma segura e com sucesso.</p> <p>Segurana pessoal geral Cada indivduo realizando as prticas sugeridas ou qualquer outra investigao responsvel pela sua prpria segurana e tambm pela segurana de outros que podem ser afetados pelo seu trabalho (outros estudantes, tcnicos e professores). O indivduo deve incluir no planejamento e realizao destas investigaes uma avaliao de riscos para avaliar qualquer perigo que a avaliao possa possuir e maneiras de minimiz-los. Tcnica assptica Equipamento e meio estreis devem ser utilizados para transferncia e cultura de microrganismos. Tcnica assptica deve ser observada sempre que micorganismos so transferidos de um recipiente para outro. Equipamentos contaminados devem ser preferencialmente esterilizados por calor podendo ser incinerado ou autoclavado. Um desinfetante qumico adequado deve ser utilizado, mas este no pode garantir a completa esterilizao. Segurana eltrica Cuidado deve ser tomado para que nenhum lquido entre em contato com a tomada eltrica. Antes de ligar qualquer equipamento verifique se a corrente eltrica adequada ao equipamento.</p> <p>PRTICA 1FATORES QUE INTERFEREM NO PROCESSO FERMENTATIVO</p> <p>EXPERIMENTO 1 Uma das melhores formas de aprender alguma coisa fazendo esta coisa! Por isso, os experimentos selecionados o ajudaro a entender melhor os fenmenos envolvidos no processo de fermentao. Aps realizar os experimentos, responda os questionrios propostos. Pois assim, voc poder identificar quais so as suas dvidas e procurar solucion-las. Experimento n 1 - Observao Microscpica Com a realizao deste experimento voc poder entender melhor como as leveduras se desenvolvem, a influncia do meio no seu crescimento, entre outros aspectos importantes envolvidos no processo de fermentao. Material necessrio:1) 2) 3) 4) 5)</p> <p>3 Frascos colheres (uma pequena e outra grande) Fermento biolgico (fabricao de po) Acar gua morna (20 - 25C) e gua gelada (5 C)</p> <p>Procedimento: 1) Primeiramente, numere os 3 frascos. 2) Frasco 1: coloque uma colher (pequena) rasa de fermento e 2 colheres (grandes) de gua morna 3) Frasco 2: coloque uma colher (pequena) rasa de acar , uma colher (pequena) rasa de fermento e 2 colheres (grandes) de gua morna 4) Frasco 3: coloque uma colher (pequena) rasa de acar , uma colher (pequena) rasa de fermento e 2 colheres (grandes) de gua gelada (5) Houve alguma mudana com o decorrer do tempo? O frasco n 2 apresentou os mesmos resultados dos outros dois? Voc saberia explicar este comportamento? O que a fermentao de fato? Que reaes ocorrem</p> <p>durante o processo fermentativo? Quais os responsveis pelas alteraes nos frascos? O Que Voc Aprendeu com o Experimento 1?</p> <p>Aps a realizao deste experimento, voc dever ser capaz de : 1) explicar a importncia do acar, da gua e do fermento na fermentao. Logo, tambm saber explicar a influncia do meio no qual a fermentao se desenvolve.</p> <p>2) perceber que o processo fermentativo pode ser afetado por diversos fatores que alteram a velocidade em que este ocorre. Voc saberia dizer quais so estes fatores?</p> <p>EXPERIMENTO 2:ACOMPANHAMENTO DO CRESCIMENTO DE UMA POPULAO DE LEVEDURA</p> <p>1. REFERENCIAL TERICO: Acompanhar a curva de crescimento em meio liquido, em cultura descontinua, de uma populao da levedura Saccharomyces cerevisiae. O crescimento da cultura de levedura ser conduzido em agitador orbital (agitao constante de 250 rpm - rotaes por minuto), temperatura constante de 25C. A curva de crescimento ser obtida com base na determinao espectrofotomtrica da Densidade ptica (DO) da cultura, medida no comprimento de onda de 640nm (DO640nm), ao longo do tempo de incubao. Pretende-se determinar a taxa especfica de crescimento e o tempo de duplicaao da cultura de levedura nas condies ensaiadas. Curva de crescimento microbiano O crescimento microbiano frequentemente acompanhado com base na curva que representa o crescimento de uma populao de um determinado microrganismo, em sistema fechado ou em batch (cultura em descontnuo). Neste caso, um meio de cultura liquido contendo os nutrientes necessrios ao crescimento celular inoculado com uma populao de clulas viveis do microrganismo e incubado em condies ambientais favorveis sua multiplicao. Se acompanharmos o crescimento da populao de clulas ao longo do tempo e representarmos graficamente o logaritmo do nmero de clulas por unidade de volume (ou, da Densidade ptica da cultura, D.O, ou da concentrao da Biomassa Microbiana, X) em funo do tempo, obter-se- uma curva caracterstica, como ilustrado na figura abaixo, que exibe as vrias fases do crescimento microbiano em descontnuo e cujo significado descrito abaixo.</p> <p>Fases do crescimento em cultura descontnua Fase de latncia (ou "LAG") Durante o perodo de tempo que se segue inoculao do meio de cultura, as clulas dos microrganismos tm normalmente que se adaptar ao novo meio. Durante este perodo inicial, pode no ocorrer multiplicao celular. Durante este perodo verifica-se, por exemplo, a sntese de novas enzimas. Estas podem ser necessrias sntese de compostos essenciais ao crescimento e que no se encontrem presentes no meio de cultura ou para a hidrlise ou metabolizao dos compostos presentes e que so as nicas fontes de carbono a que o organismo no se encontra adaptado. Esta fase dita de latncia pode ter uma durao mais ou menos extensa de acordo com o estado fisiolgico da cultura usada como inculo e as condies de crescimento. Por exemplo, a presena de um percentual elevado de clulas no-viveis no inculo, um meio de cultura contendo um nutriente essencial difcil de metabolizar ou a incubao em condies ambientais de estresse a que o organismo no se encontra adaptado, conduzem normalmente a fases de latncia extensas. Fase exponencial Aps um curto perodo de acelerao, a taxa de crescimento da populao microbiana torna-se constante, isto , as clulas sofrem diviso e o seu nmero duplica aps um determinado intervalo de tempo. Durante esta fase, em que todos os nutrientes esto presentes em excesso, os microrganismos dividem-se e a populao cresce com uma taxa especfica de crescimento mxima que depende do potencial gentico do microrganismo, da composio do meio de cultura e das condies de crescimento (temperatura, pH, disponibilidade de gua, etc.).</p> <p>Fase de desacelerao Durante esta fase ocorre um declnio da taxa especfica mxima crescimento, em resultado da diminuio para valores limitantes crescimento da concentrao de um ou mais nutrientes essenciais metabolismo celular e/ou do aumento da concentrao de produtos metabolismo txicos para as clulas. Fase estacionria Na fase estacionria o esgotamento de um nutriente essencial e/ou a acumulao de produtos inibidores do metabolismo provoca a parada de diviso da populao. No entanto, em carncia de nutrientes, as clulas podem manter-se viveis durante perodos de tempo mais ou menos longos, custa das reservas endgenas, que usam em processos de manuteno. Contudo, mais cedo ou mais tarde, verifica-se um declnio da concentrao de clulas viveis durante a fase de morte celular. Fase de morte Durante a fase de morte ocorre a perda irreversvel da capacidade de diviso celular (morte celular), o que origina um decrscimo da concentrao de clulas viveis na populao microbiana ao longo do tempo. Como realizar a curva de crescimento de uma populao microbiana Para acompanhar e traar a curva de crescimento de uma populao microbiana necessrio fazer a avaliao quantitativa da evoluo da concentrao de clulas ao longo do tempo. Esta avaliao pode basear-se em mtodos diretos ou indiretos. Mtodos Diretos: contagem de clulas totais; contagem de clulas viveis; determinao da biomassa seca. Mtodos indiretos: Anlise espectrofotomtrica da Densidade ptica (D.O.) da cultura Na prtica, o crescimento geralmente acompanhado com base na determinao da Densidade ptica da cultura, da concentrao de clulas (totais ou viveis) ou da massa celular (biomassa). de do ao do</p> <p>Contagem de clulas totais Este mtodo baseia-se no preenchimento de uma cavidade situada entre uma lmina e uma lamnula com uma suspenso de clulas. Esta cavidade, localizada no centro da lmina, encontra-se dividida em quadrados de dimenses bem definidas e, assim, de volume conhecido. Utilizando o microscpio, possvel contar o nmero de clulas presentes em cada quadrado e, assim, conhecer o nmero de clulas por unidade de volume, como ilustrado na figura acima. A lmina utilizada para este tipo de contagem denominada de Cmara de Neubauer. A contagem direta ao microscpio permite estimar fcil e rapidamente o nmero total de clulas numa populao microbiana. Porm, apresenta vrias limitaes,como: no permite distinguir clulas viveis de clulas mortas; clulas muito pequenas, como o caso das clulas de muitas bactrias, so difceis de distinguir; um mtodo pouco preciso; o fraco contraste entre as clulas transparentes e o meio circundante, quando a amostra no corada, dificulta (ou inviabiliza) a contagem. Nestes casos, necessrio utilizar um microscpio de contraste de fase; clulas mveis devem ser imobilizadas antes de se proceder contagem.</p> <p>Contagem de clulas viveis Este mtodo tambm conhecido como Contagem de Unidades Formadoras de Colnias (UFCs). Na contagem direta ao microscpio mencionada anteriormente so contadas tanto clulas viveis como clulas mortas. Em muitos casos estamos interessados somente na contagem do nmero de clulas viveis. O modo usual de realizar uma contagem de clulas viveis consiste em determinar o nmero de clulas capazes de formar colnias num meio de cultura slido com composio adequada ao crescimento do microrganismo. Assume-se que cada colnia originada a partir de uma nica clula vivel, o que nem sempre verdade (p. ex. duas ou mais clulas que formam um agregado , daro origem a uma nica colnia). Por isso, os resultados so normalmente expressos em Unidades Formadoras de Colnias (UFCs) e o mtodo pode ser designado por contagem de UFCs.</p> <p>Estimativa da biomassa seca Envolve a pesagem das clulas microbianas. Corresponde frequentemente determinao do peso seco das clulas presentes num determinado volume de cultura. As clulas so filtradas ou centrifugadas, lavadas e secas numa estufa (usualmente a 80C) at peso constante. Este processo muito demorado. usado em circunstncias especficas, como, por exemplo quando se pretende obter o rendimento em biomassa do crescimento.</p> <p>Anlise espectrofotomtrica da Densidade ptica (D.O.) de uma cultura microbiana A avaliao da turbidez de uma cultura microbiana constitui um mtodo rpido, embora indireto, de estimar a concentrao celular. Um feixe de luz focado numa suspenso microbiana parcialmente desviado (disperso da luz) pelas clulas, e a percentagem de luz no desviada (transmitncia, T) medida atravs de um espectrofotmetro. A quantidade de luz que atravessa a suspenso celular depende da concentrao de clulas na suspenso e do tamanho destas, do comprimento de onda e da intensidade (I0) da luz incidente e do dimetro do tubo que contm a suspenso celular. A Densidade ptica (D.O.) da cultura corresponde Absorvncia, que determinada com base na expresso D.O = log (I0/I)), onde Io a intensidade da luz incidente e I a intensidade da luz transmitida atravs da suspenso de clulas. Comprimentos de onda geralmente usados para medio da Densidade ptica de suspenses de clulas de bactrias ou leveduras incluem 540, 600 ou 640 nm.</p> <p>Figura: Representao do percurso efetuado pelo feixe de luz emitido pela fonte num espectrofotmetro (percurso ptico). A fotoclula (detector) quantifica a luz que no foi desviada pelas clulas presentes na suspenso microbiana, I, medindo-se a Densidade ptica (D.O) dessa suspenso (com base na Absorvncia).</p> <p>Figura: Para suspenses celulares muito concentradas deixa de haver uma relao linear entre a D.O. da cultura e o nmero de clulas na suspenso celular (grfico esquerda). Exemplo de duas curvas de crescimento reais, obtidas com base na medio da D.O. da suspenso celular ao longo do tempo, para dois microrganismos diferentes (grfico direita).</p> <p>Existe, dentro de certos limites, uma relao linear entre a Absorvncia ou D.O. da cultura e o nmero total de clulas por mililitro de suspenso, ou seja a concentrao celular. Contudo, para suspenses celulares muito densas frequentemente necessrio diluir as culturas de modo a que todos os valores de D.O. medidos estejam includos na parte linear da curva D.O. versus concentrao celular (ver grfico do lado esquerdo). Este mtodo no permite distinguir entre clulas viveis e clulas mortas e no permite obter diretamente valores absolutos da concentrao de clulas. CRESCIMENTO EXPONENCIAL Caracterizao O crescimento exponencial de uma populao microbiana em suspenso em meio lquido caracterizado pela duplicao do nmero de clulas e, por conseguinte, da massa (biomassa). No processo de duplicao de um microrganismo durante a fase de crescimento exponencial, aps a duplicao (ou replicao) do material gentico a clula divide-se para dar uma clula-filha com as mesma caractersticas da clula inicial. Tempo de gerao ou duplicao:</p> <p>O tempo de gerao ou duplicao de um microrganismo definido como o tempo necessrio para que ocorra uma gera...</p>