Biotecnología - Tesis Doctoral

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    16-Oct-2015

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  • INSTITUTO DE CIENCIA MOLECULAR

    ESTUDIO TERICO DE MECANISMOS DE REACCIONES ENZIMTICAS CON TRANSFERENCIA DE HIDRGENO:

    LACTATO DESHIDROGENASA

    SILVIA FERRER CASTILLO Valencia, 8 Marzo 2006

  • Ignacio Tun Garca de Vicua, profesor titular de Qumica Fsica del departamento de Qumica Fsica de la Universidad de Valencia y Vicent Moliner Ibez, profesor titular de Qumica Fsica del departamento de Ciencias Experimentales de la Universidad Jaume I de Castelln, CERTIFICAN: Que el trabajo con ttulo: Estudio Terico de Mecanismos de Reacciones Enzimticas con Transferencia de Hidrgeno: Lactato Deshidrogenasa ha sido realizado por Silvia Ferrer Castillo bajo nuestra direccin, para optar al grado de doctora en Qumica. As, autorizan la presentacin de este trabajo a efectos de seguir los trmites correspondientes de la Universidad de Valencia. Valencia, 8 Marzo de 2005. Dr. Ignacio Tun Garca de Vicua Dr. Vicent Moliner Ibez

  • A mis padres y a Rober

  • ... La cincia es una senda per a caminar, no s una estaci per a arribar i quedar-se parat.

    V. Sos Baynat

    Tengo una pregunta que a veces me tortura: Estoy loco yo? o los locos son los dems

    Albert Einstein

  • NDICE GENERAL

    I

    NDICE GENERAL PRLOGO I ACRNIMOS V CAPTULO 1. INTRODUCCIN 1 1 BIBLIOGRAFA 6 CAPTULO 2. OBJETIVOS 9 CAPTULO 3. FUNDAMENTOS Y MTODOS 13 1 SUPERFICIES DE ENERGA POTENCIAL 16 2 MTODOS HBRIDOS QM/MM 23 2.1 FUNCIN ENERGA 23 2.2 TOMOS FRONTERA 26 2.3 LIMITACIONES Y MEJORAS DEL MTODO QM/MM 28 2.3.1 MTODOS DE ENLACE DE VALENCIA SIMPLE 30 2.3.2 MTODO DE CORRECCIONES INTERPOLADAS 31 3 LOCALIZACIN DE PUNTOS ESTACIONARIOS EN SISTEMAS DE ALTA DIMENSIONALIDAD 34 4 DINMICA MOLECULAR Y ENERGAS LIBRES 37 4.1 DINMICA MOLECULAR 37 4.2 ENERGAS LIBRES EN TERMODINMICA ESTADSTICA 42 4.3 MTODO DE PERTURBACIN DE LA ENERGA LIBRE 45 4.4 MTODO DE INTEGRACIN TERMODINMICA 47 4.5 MTODO DE CRECIMIENTO LENTO 48 4.6 MTODO DE POTENCIALES DE FUERZA MEDIA 49 4.6.1 CONCEPTO DE POTENCIAL DE FUERZA MEDIA 49 4.6.2 UMBRELLA SAMPLING 52 4.6.3 MTODO DE ANLISIS DE HISTOGRAMAS PONDERADOS (WHAM) 53

    5 TEORA DEL ESTADO DE TRANSICIN 57 5.1 TEORA CONVENCIONAL DEL ESTADO DE TRANSICIN 58 5.2 TEORA VARIACIONAL DEL ESTADO DEL TRANSICIN 64 5.3 EFECTOS CUNTICOS 66 5.4 TEORA VARIACIONAL DEL ESTADO DE TRANSICIN PARA MEDIOS ENZIMTICOS 70 6 ENZIMOLOGA 75 6.1 CINTICA ENZIMTICA 76 6.2 ESTADO DE PROTONACIN Y REACTIVIDAD 81 6.3 MUTAGNESIS 86

  • NDICE GENERAL

    II

    7 BIBLIOGRAFA 89 CAPTULO 4. LACTATO DESHIDROGENASA 99 1 BIOQUMICA 104 2 RESULTADOS 109 2.1 CLCULOS PRELIMINARES 109 2.2 PARMETROS DE INTERACCIN QM/MM 113 2.3 COORDENADAS DE REACCIN 116 2.4 CONSTRUCCIN DE UN NUEVO MODELO 117 2.5 EXPLORACIN DE LA SEP PARA EL TETRMERO 119 2.6 CORRECCIONES A LA DESCRIPCIN CUNTICA 121 2.6.1 CORRECCIONES SVB 122 2.6.2 CORRECCIONES INTERPOLADAS UNIDIMENSIONALES 124 2.6.3 CORRECCIONES INTERPOLADAS BIDIMENSIONALES 126 2.7 AMPLIACIN DE LA PARTE QM 129 2.8 ESTADO DE PROTONACIN DE LOS RESIDUOS 134 2.9 ESTUDIO DE LA CINTICA DE LA REACCIN QUMICA 140 2.9.1 EXPLORACIN DE LA REGIN DEL ET 145 2.9.2 ANLISIS DEL ESTADO DE REACTIVOS 149 2.9.3 CLCULOS DE ENERGA LIBRE 156 2.9.4 EFECTO TNEL 161 2.9.5 KIES 162 2.10 MUTACIONES 163 2.10.1 ARG109GLN 166 2.10.2 ASP168ALA 170 2.10.3 DOBLE MUTACIN ARG109GLN Y ASN14ASP 173 2.10.4 DOBLE MUTACIN ARG109GLN Y ASN140GLU 176

    3 CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS DE FUTURO 178 4 BIBLIOGRAFA 181 CAPTULO 5. DIHIDROFOLATO REDUCTASA 187 1 BIOQUMICA 191 2 RESULTADOS 194 2.1 RESULTADOS EN FASE GAS 195 2.2 RESULTADOS EN EL SENO DE LA ENZIMA DHFR 200 3 PERSPECTIVAS DE FUTURO 208 4 BIBLIOGRAFA 210 ANEXO 215

  • PRLOGO

    I

    PRLOGO

    e resulta muy difcil resumir el trabajo de una Tesis

    Doctoral e incluir todos los pasos que se han dado a lo largo

    del camino en mi formacin investigadora. Durante estos

    aos he tenido la oportunidad de trabajar con personas y visitar lugares

    increbles. El conjunto de toda esta experiencia me ha trado a este tramo

    final en el que hay que recopilar todo el trabajo y plasmarlo en un texto

    escrito.

    Adems de la necesidad de transcribir todo el trabajo doctoral

    en un nico libro, he tratado que este trabajo quedara, dentro de su

    complejidad, como herramienta til para generaciones venideras de

    nuevos jvenes investigadores y as, con mi granito de arena, ayudarles a

    comprender un poco mejor el mundo de la Qumica Computacional.

    El prlogo de esta Tesis Doctoral sirve como seccin de

    agradecimientos ya que no quiero olvidar a la gente que me ha ayudado a

    llegar a este punto y final (aunque espero que en realidad sea un punto y

    seguido). No quisiera dejar pasar la oportunidad de agradecer a las

    personas que han influido en mi trabajo tanto directa como

    indirectamente. No obstante, adelanto que no voy a utilizar ningn

    nombre propio. No por el hecho de que quizs enumerndolos uno a uno

    la extensin del prlogo superara la de la totalidad de la Tesis, sino

    porque durante este tiempo he intentando personalizar mi

    agradecimiento individualmente, con una sonrisa, un gesto, un guio;

    esas personas ya sabis quienes sois.

    Para comenzar, tengo un especial agradecimiento, con mucho

    cario, para mis directores de tesis que me han conducido por la senda

    M

  • PRLOGO

    II

    todos estos aos, sin dejar que me perdiera en el camino. En ellos he

    encontrado un grado de compresin y ayuda que yo misma no he sabido

    valorar en ocasiones. Me han enseado una filosofa del mundo de la

    ciencia que agradezco de corazn y espero no haberles dado demasiados

    quebraderos de cabeza con mi manera de ser y afrontar las cosas.

    Adicionalmente, quiero agradecer a los directores no oficiales de

    mi trabajo, aquellos que me han transferido sus conocimientos de manera

    extraordinaria y genial. Con los que he compartido artculos, discusiones

    y anlisis de resultados y mucha paciencia por su parte.

    Para continuar mis agradecimientos, quiero destacar que mi

    trabajo de tesis lo he llevado a cabo entre dos grupos de investigacin en

    su mayor parte (entre ciudades cercanas) y de otros dos donde he

    realizado estancias cortas pero intensas (un poco ms lejos de mi hogar).

    Me siento una privilegiada por haber podido compartir despacho con mis

    compaeros. Me he sentido arropada y querida. Y he podido compartir

    con ellos muy buenos momentos. La carga de los instantes malos: en los

    que no te da un resultado o se te ha borrado el scratch; la he llevado

    mucho ms liviana. Y s que he podido contar con vuestra ayuda

    desinteresada por lo que quiero que conste que os lo agradezco, desde los

    que ya se han ido hasta los que llevan menos tiempo. Da gusto ir a

    trabajar con el ambiente de buen rollo. Por supuesto, en este prrafo

    incluyo los que han compartido conmigo durante las estancias, ha sido

    menos tiempo pero les tengo un gran afecto.

    Tambin agradezco a la gente del departamento, o de la

    Universidad en general, con la que no he compartido despacho

    directamente pero que hemos compartido muchos momentos; me han

    disipado dudas existenciales (o me las han generado) y me han animado

    (incluso a veces desanimado) en mi trabajo. Con ellos he compartido

  • PRLOGO

    III

    profundos debates en el caf o charlas banales; cenas y celebraciones, y

    siempre percibido un especial cario y amabilidad.

    Agradezco el apoyo de mis amigos (de los que tena antes y los

    que han ido apareciendo por el camino, los que han ido dejando de llamar

    y los que continan llamando). Agradezco el apoyo mis familiares

    cercanos y lejanos, que muestran un respeto especial y admiracin por mi

    trabajo aunque no estn muy seguros de lo que hago. Familia ajena a la

    Universidad que me pregunta cmo llevo la tesis. A los amigos y

    familiares, os lo agradezco porque durante los ltimos meses me habis

    dejado quedar menos, vernos poco y aceptado mis excusas de que estaba

    liada con la tesis y no poda quedar. Ahora, por lo menos veris que no

    era una excusa y que realmente estaba haciendo lo que os deca:

    escribiendo la tesis.

    Agradezco a mis padres su amor y su entrega incondicional,

    insistiendo siempre en que siguiera mi camino, que estudiara, que yo

    serva para esto. Estos aos me han cuidado (mimado en exceso) sin

    reprocharme mis olvidos, mis manas, mi desorden y mis cambios de

    humor. S que estis orgullosos de m pero no s si sabis que yo estoy

    orgullosa de vosotros.

    A mi compaero en la vida, que me ha influido estos aos para

    ser mejor persona, para comprender ciertas actitudes de los dems,

    aceptando las crticas con mesura. Gracias, porque tu mana por el orden

    me ha hecho ser ms ordenada y sistemtica, porque me