BSA ve biyosensorler

  • Published on
    01-Jul-2015

  • View
    132

  • Download
    1

Embed Size (px)

Transcript

<p>Biyosensrlere genel bir bak ve biyosavunmada kullanlan biyosensrlerDr. Mustafa F. Abasyank*, Ergn akalar**, Mehmet enel***, Fatih niversitesi, Genetik ve Biyomhendislik Blm*, Biyoloji Blm**, Kimya Blm***</p> <p>zet:Biyolojik yapdaki analitleri alglayan sensrler biyosensrlerdir. Biyolojik Saldr Ajanlar biyolojik yapdaki toksin, hasta yapc veya vcut dengesini bozucu ajanlar olup son yllarn sava ve terrist saldrlarnda sklkla kullanlmakta veya kullanlmalar planlanmaktadr. Bilim dnyas bir yandan yeni BSAlar zerine alrken bir yandanda var olan BSAlar ksa srede tesbit edebilecek biyosensrler zerine ura vermektedir. Nkleik asit tabanl biyosensrler ok hassas olmalarna karn zaman ve kusursuz bir iilik istediinden ani saldrlarn tesbitinde yetersiz kalmaktadr. Ajanlarn yzey zelliklerine gre tesbit yntemleri gn getike gelitirilmektedir. Bu makalemizin amac sensr ve biyosensr teknolojisini ve de BSA oriyentit dizayn edilen biyosensrlerden bazlarn ve alma yntemlerini tantmaktr.</p> <p>BiyosensrlerSensr ve biyosensr tanmlarSensrler fiziksel olgular elektrik sinyallerine dntren cihazlardr. Mekanik duyu organlarda diyebileceimiz bu cihazlar, alma ekillerine gre ve dntrc (ing: tranducer) ad verilen yaplarna gre eitlere ayrlmaktadr. Termal, mekanik, kimyasal, akustik, radyoaktif sensrler ve biyosensrler bunlardan bazlardr. lgi alanmza giren biyosensrler genel olarak, biyolojik yapdaki analitleri hisseden sensrler veya reseptr birimi biyomolekler yapda olan sensrlerdir.</p> <p>Biyosensrn ana gvdesini oluturan paralarBiyosensrler bir ok sensr gibi reseptr ve dntrc olmak zere iki ana yapdan ibarettir. Eer reseptr biyomolekler bir yapda ise buna biyoreseptr ad verilir (ekil 1). Biyoreseptrler analiti fark edebilen biyomolekllerdir. Dntrcler ise biyoreseptrn analiti fark ettii esnada rettii kimyasal veya fiziksel sinyali elektrik sinyallerine dntren yaplardr. Biyosensrler sayesinde normalde uzun tahliller gerektiren analizler daha ksa srede yaplabilmektedir. Mesela glikoz biyosensrleri kandaki glikoz seviyesini ksa srede lebilmektedir. Ayn lm normalde geleneksel yntemlerle daha uzun srede yaplabilmektedir. Ksa srede sonuca ulatrmas ve uygulama kolayl biyosensrlerin en nemli 2 avantajlarndandr . biyoreseptr Biyoreseptrler: Biyoreseptr olarak deiik analit biyomolekller kullanlabilmektedir. Bu biyomolekllerden en ok kullanlan enzimlerdir. Enzimler hedef molekllere kar olduka zgldr. Binlerce farkl analit iinden hedef analiti Dntrcekil 1 Bir biyosensrn konfigrasyonu</p> <p>seip reaksiyon oluturabilen bu biyokatalizatrlerin dntrclere bir ekilde immobilize edilmesi yani yaptrlmas gerekmektedir. Matrikse fiziksel hapisleme veya kimyasal balama yntemleri analiti tanyan biyomolekllerin dntrclere immobilizasyonunda kullanlan stratejilerdir. Kimyasal balama ynteminde biyomolekl dntrc yzeyine uygun bir reaktif tarafndan kovalent olarak balanr. ok az sayda biyomolekln balanmas bile biyosensrn etkili almas iin yeterli olabilir. Dntrcler: Biyoreseptrn analiti tandktan sonra ortamda oluan fiziksel veya kimyasal deiimi alglayp bunu llemebilir dijital sinyallere dntren cihazlardr. Tm bunlar bir rnekle biraz daha aalm: Glikoz biyosensrleri kandaki glikoz konsantrasyonunun tesbitinde kullanlrlar. Burada analit glikoz iken glukoz oksidaz enzimi biyoreseptr olarak kullanlr. Aadaki reaksiyon emasnda grld gibi iki yeni rn reaksiyon sonucunda oluur. Glikoz oksidaz Glikoz + O2 Glukonik asit + H2O2 Burada kullanlacak dntrc, 3 farkl kimyasala odaklanabilen 3 farkl dntrcden biri olabilir. 1. Oksijen sensr: Ortamda kullanlan oksijen miktarn ler ve bunu anlalabilir sinyal olan elektrik akmna dntrr. 2. pH sensr: Glukonik asit ortamn pHn drr. Bir pH sensr olan dntrc ortamn pHna bakarak yklan glikoz miktarn tesbit edebilir. Dntrc ile pH deiimi voltaj deiimine sebep olur. 3. H2O2 sensr: Dntrc ortamdaki H2O2 konsantrasyonunu ler ve elektrik akmna dntrr3.</p> <p>Nitelikli Biyosensrlerde Aranan zelliklerinBiyosensrler sekiz parametreye gre nitelendirilirler: (i). Duyarllk (ing:sensitivity): Cihazn analitteki deiime (konsantrasyon) birebir cevap vermesi demektir. Duyarllk yksekse analitteki birim deiim sensrn ekrannda aynen gzkr. (ii). Seicilik (ing:selectivity): Cihazn sadece analite zgnln gsterir. Cihaz baka reaktiflere ilgi gstermez ve hatal sonu vermez. (iii). lm aral: Cihazn lebildii analit konsantrasyonun araldr. Analit belli bir konsantrasyondan az veya oksa cihaz iyi bir duyarllkta sonu vermeyebilir. (iv). lm sresi: Analit konsantrasyonundaki bir basamak deiime kar cihazn verecei nihayi yantn sadece %63lk ksmn lmek iin gsterdii lm sresidir. Bir tr cihazn lme hzn gsterir. (v). Tutarllk: Cihazn sonularndaki tutarll ifade eder. (vi). Tesbit snr: Cihazn tesbit edebilecei en dk analit konsantrasyonunu ifade eder. (vii). mr: Cihazn, performansnda gzle grlr bir azalma olmadan verdii hizmet mrn ifade eder. (viii). Kararllk: Belirli bir sre iinde cihazn duyarllndaki veya baz izgisinde deiimleri dikkate alan bir kalite lm deeridir2,3.</p> <p>Biyosensr Dizaynnda Dikkat Edilmesi GerekenlerBiyosensr tasarmlarnda nce biyosensrn hangi analiti tanyaca tesbit edilmelidir. Sonrasnda ise aadaki maddeler dikkate alnarak biyosensrler dizayn edilmelidir. Bunlar srasyla; (i). Analite uygun biyoreseptrn (tanyc molekln) seimi, (ii). Biyoreseptr dntrcye sabitlemede kullanlacak uygun ve verimli immobilizasyon metodunun seimi, (iii). Biyoreseptrn analiti tanmasyla oluan kimyasal veya fiziksel sinyali anlaabilir sinyal formuna dntrecek olan dntrcnn seimi ve dizayn, (iv). lm aralnn, duyarlln ve lmlerdeki parazitlerin dikkate alnmas, (v). Cihazn kompakt bir hale dntrlmesi, olarak sralanabilir. Tm bunlar yapmak iin ise bir ok alanda geni bir bilgi birikimine ihtiya vardr. Mesela, birinci k iin biyokimya ve biyoloji, ikinci ve nc iin kimya, elektrokimya ve fizik ve drdnc iin kinetik ve ktle transferi alanlar bunlardan bazlardr. Biyosensr dizayn edilir edilmez sra onun elverili imalat ve kullanma iin uygun bir ekilde paketlenmesine gelir. Modern imalat teknolojileri ve stratejileri sayesinde ok daha az maliyetle biyosensr retimi mmkn olmaktadr. Tasardan imalata tm bu basamaklarda oklu-disiplinlerin bir arada kafa kafaya almas son derece nemlidir2.</p> <p>Biyosensr UygulamalarBiyosensrler birok alanda kullanlmaktadr. Tp: Metabolitlerin llmesi, insulin eksiklii belirtilerinin llmesi, hastane koullarnn gzlenmesi , yapay pankreasn alma koullarnn kontrol, vb. Endstri: Endstriyel proses kontrollerinde gereklidir. Biyoreaktrlerin kontrol, giren hammadde ve kan rnlerin llmesi, vb. evresel Denetim: evre Koruma Ajans (ing:EPA (Environmental Protection Agency) EPA tarafndan hava ve su dzenli olarak izlenmektedir. Ayrca yerel idari mercilerin de blgesel izleme birimleri bulunmaktadr. Bu birimler dzenli olarak hava ve suyu tahlil etmektedirler.</p> <p>Savunma (askeri ve sivil): Askeri ve sivil savunma alannda kullanlmak zere bir ok sensr ve biyosensr dizayn ve imalatna, son krfez krizi ve 11 Eyll sonrasnda hz verilmitir. Herhangi bir biyoterr ve biyosaldr sonras erken tesbit ve analiz iin ok gl ve tanabilir biyosensrler en elzem cihazlardandr. Bu konu ilerde daha detayl verilecektir2.</p> <p>Biyosensrlerin Ksa TarihesiClark ve Lyons (1962) ilk defa biyosensr terimini ifade etmilerdir. Enzim-elektrot kompleksini imal eden ikili, bu kompleksi glikoz sensr olarak kullanmlardr. Sensr, oksido-reduktaz enzim olan glikoz oksidazn pletanyum elektroduna immobilize olmasndan ibarettir. Pletenyum elektrod enzim tarafndan retilen H2O2 tarafndan +0.6Vda</p> <p>ekil 2. Clarkn enzim elektrodu</p> <p>polarize olur. te basite bu prensibe gre alan tarihin ilk biyosensr 1974 ylnda piyasada Yellow Spirngs Instrument (YSI) olarak grlmtr. YSI sensrnn gelitirilmesinde ana zellik yeni nesil membranlardr. Clark burada sandevi membran kullanmtr. Enzim nkleopor polikarbonat membran ve selluloz asetat membran arasna hapsolmutur. Bu membranlar normalde ortamn potansiyel yapsn etkileyecek olan dier faktrleri elimine etmekte ve cihazn duyarlln ve zgnln artrmaktadr. Mesela, Clarkn kulland membran H2O2 diffze ederken askorbat ve dier parazitik kimyasallarn geiini engellemektedir2.</p> <p>Biyoreseptr Moleklleri (ekil 3)Enzimler: Bata da belirtildii gibi biyoreseptr molekllerinin en ok bilineni enzimlerdir. Sensrn analite olan zgnl aslnda biyoreseptrn analite kar zgnlnden baka bir ey deildir. Enzimlerin substratlarna kar olduka yksek bir zgnl, afinitesi mevcuttur. Binlerce kimyasal arasndan ilgili olduklar substrat seer ve reaksiyonu katalizlerler. Tabi tm dier reaksiyonlarda olduu gibi enzimatik reaksiyonlarda da ortamn scakl, pHs, iyonik kudreti ve dier evre artlar nemli rol oynar. Antikorlar: Antikorlar bir glikoproteindir. Kandaki proteinlerin %20sini oluturular ve immnoglobinler diye de adlandrlrlar. Y eklinde olup iki adet antijen tanma blgesi ihtiva ederler. Baklk sisteminde antikorlar tarafndan tannan ve immn cevap oluumuna sebep olan yabanc molekllere antijen ad verilir. Antikorlar genelde birbirlerinden ayran farkllk antijen tanma blgeleridir. Her farkl antikor kendine zgn olan antijeni tanr ve ona geici olarak balanr. Kovalent olmasa da gl bir balanma yaptndan antijen-antikor balanma stratejisi bir ok modern tan metodunda kullanlmaktadr. zellikle monoklonal antikor retim teknolojisi sayesinde artk herhangi bir antijene zgn IgG tipi monoklonal antikorlar retilmekte ve retilen bu antikorlar biyosensr teknolojisinde de kullanlmaktadr2. Aptamerler: Genel olarak aptemerler rastgele sentezlenmi tek zincirli oligonkleotidlerdir. nce oligonkleotid sentezleyicisine zincir dizim sekans bakmndan rastgelelik gsteren trilyon adet farkl sentetik oligonkleotid rettirilir. Baz dizimi farkl olan herbir molekl, farkl boyutlu yapya sahiptir. Dolaysyla bu kadar farkl molekl, tannmas dnlen analitle muamele edilir ve hangi rastgele retilen oligomerik molekln analite kar yksek balanma kapasitesine sahip olduu SELEX ad verilen zel bir yntemle tesbit edilir. Sonrasnda tesbit edilen oligomerin sekans belirlenip sentezleyiciye ikinci defa ama bu sefer bilinli olarak bu moleklden rettirilir; rnler ise biyosensr teknolojisinde biyoreseptr olarak kullanlr. Monoklonal antikorlara rakip olan bu molekller gn getike uygulamada kendini daha fazla gstermektedir. Hatta son 10 yl iinde zel yntemlerle retilen aptamer proteinlerin bazlarnn altn ve bakr gibi madenlere kar bile zgn balanma gsterdikleri grlmtr. Bu da, zellikle yer alt sular zerinden maden aramalar yapmak iin orijinal biyosensr imalatnn yaplabileceinin iaretini vermektedir1. Reseptr proteinler: Reseptr proteinler biyolojik aktif bileikler iin yksek ama zgn balanma gcne sahiptirler. Yani, herbir farkl reseptr protein yalnzca kendine has bileie balanabilir. Bu zelliklerinden dolay biyoreseptr olarak biyosensr teknolojisinde kullanlmaktadrlar. Mesela, normalde hcrelerdeki lm reseptrleri apoptosis sinyali veren ligandlara kar kullanlr. Hcre bu ligandlar bu reseptrlerle hisseder ve apoptosisi (planl hcre lm) balatr. Sensr teknolojisinde</p> <p>bu reseptrler kullanlarak evremizde retilen hangi kimyasaln apoptotik sinyale sebebiyet verdii anlalmaktadr. Dier Adaylar: Dnyamzda, biyosensrlerde biyoreseptr olarak kullanlmaya aday bir ok biyolojik materyal bulunmaktadr. Bakteriler, hcreler, organeller, membran tabakalar bunlardan bazlardr. Herhangi bir biyomateryalin biyoreseptr amal kullanm iin tek koul, materyalin istenilen analiti bir ekilde zgn olarak tanma kapasitesine sahip olmasdr2. Tablo 1. Biyosensrlerde Kullanm Muhtemel Bioreseptrler</p> <p>Biyoreseptr eitleriOrgan paras (rn:olfaktori) Doku Hcrenin kendisi Hcre organeli (rn.:mitokondri) Biyomembran (rn.:reseptrler) Enzim Antikor</p> <p>Yapsal btnlk iin gerekli olan ana ihtiyaBozulmam doku Besin ve oksiyen temini Ozmatik ve asidik kararllk Mekanik koruma pH ve elektrolikit kararllk pH kararll</p> <p>retilen sinyal eidiAksiyon potansiyeli Metabolik son rn Elektron zincir rnleri Salnan ierikler Reaksiyon rn Antijen tutumu/ ktle fark</p> <p>Biyosensrlerde Dntrc eitleri ve zellikleri (ekil 3)Geleneksel Dntrcler: Geleneksel dntrcler 3 eittir. Bunlar; H2O2 veya O2 lmlerine odaklanan amperometre, pH veya iyon lmleri yapan potansiyometre ve fiber optik kablo kullanan fotometrelerden ibarettir. Biyotanma reaksiyonlar genelde kimyasal rnler retir ki bunlar elektrokimyasal metotlarla kolayca tesbit edilebilirler. H2O2 (veya reaktif O2) bir ift eletrod vastas ile llebilir. nce referans elektrodun karsnda olan elektroda (Ag/AgCl veya Kalomel) ufgun bir voltaj uygulanr. Bu durumda hedef molekller olan H2O2 veya O2 elektrotta yksetkenir ve ardndan bir akm oluur ve oluan bu akm amperametre ile alglanr. Potansiyometre ise bir membrann iki tarafndaki H+ farkna bakarak alr. Fotometre, oluan sinyal olarak alglar. Fiber optik kablolar oluan bu ynlendirmede kullanlrlar2. Piezoelektrik Dntrcler: Pieazoelektrik materyalleri ve yzey akustik dalga cihazlar ktle deiimine kar hassas bir ortam sunar. Bu tip dntcler, biyoreseptrde tanma reaksiyonu sonrasnda ktle art oluyor ise, ok uygundur. Mesela kuartz kristal mikrobalans (QCM) ad da verilen piezoelektrik silikon kristalleri hali hazrda pikogramlk ktle deiminlerini bile hissedebilmektedirler. QCMlere sabitlenen antikorlarn antijenleriyle karlamalaryla oluacak ktle deiimi ite bu ekilde alglanp dijitalize edilir. letkensel Dntrcler: Solusyon iletkenliindeki deimeler bir reaksiyonun hzn belirlemede kullanlabilir. Oluan iyonlarn yapt haraket sonucu iletkenlikdeki deiimleri baz alan bu teknik bir ok enzim alakal reaksiyon hzlarnn llmesinde kullanlmaktadr. Elektrik Kapasitans Dntrcleri: Kapasitans lm metodu kullanlarak oluan bir dntrcdr. Mesela, iki farkl elektrodlu levha zerine antikorlar immobilize edilse ve bir antijenantikor reaksiyonu olusa sonu doal olarak iki levha arasndaki ortamn dielektrik sabitesinde dikkate deer bir deiim meydana gelir. Bu deiim de kolayca dijitalize edilir.</p> <p>Termometrik Dntrcler: Baz biyotanmlama reaksiyonlar esnasnda ortam scakl deiir. Bu deiim gzlenerek reaksiyon dolaysyla analit varl hakknda yorum yaplabilir. Mesela ATPnin hidrolizlenmesinde veya antijen-antikor kompleksi oluumlar esnasnda meydana gelen reaksiyon sonucu ortam scakl deiir. FET Tipi Dntrcler: yon konsantrasyonlarndaki deiimi alglayabilen FETler olduka kullanldrlar (ing: field effect transistors: alan etkili transistrler)2.</p> <p>ekil 3. Biyosensrlerin biyoreseptr ve dntc eitlilii</p> <p>Biyolojik Sava Ajanlarn (BSA) Tesbitinde BiyosensrlerBSA 11 Eyll saldrlar sonras artk korkulan bir saldr tr olmaya balamtr. 1995de Tokyoda arbon saldrsndan sonra, 11 Eyll saldrlarnda da yine arbonlu mektuplar ortaya kmtr. Akabinde, bir anda dikkatler BSA zerine ynelmitir2. Terrist saldrlarn yannda, 17 farkl lkeden biyosilah retimiyle alakal projelerin yrttlmekte olduu tahmin edilmektedir. Hastalk Kontrol ve Engellenmesi Merkezi (ing:Center for Disease Control and Prevention (CDC)) tarafndan yaplan bir aratrmaya gre bir terristin ABD ehirlerinden birine kastl brakaca arbonun verebilecei ekonomik zararn maliyeti 477.8 milyon-26.2 milyar $/100 bin kii olarak hesaplanmtr3. BSAlarn Transmisyonu (Tanmas) BSAlar deiik yntemlerle yaylabilirler...</p>