Cap_4 Functiile Materialului Genetic (1)

  • Published on
    13-Oct-2015

  • View
    3

  • Download
    0

Embed Size (px)

Transcript

<ul><li><p>Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic </p><p> F </p><p>4 UNCIILE MATERIALULUI GENETIC 4.1 REPLICAREA ADN </p><p>Replicarea ADN reprezint transmiterea fidel a informaiei genetice la celulele fiice, n urma diviziunii celulare. Replicarea este una dintre cele dou funcii eseniale ale materialului genetic. Mai mult dect att, replicarea ADN este procesul de baz al continuitii vieii pe Pmnt. </p><p>4.1.1 Principalele etape ale replicrii ADN </p><p>Ca i alte procese din biologia molecular, i procesul de replicare se desfoar n 3 etape iniierea, elongarea i terminarea : </p><p> Iniierea implic recunoaterea regiunii de pe o molecul ADN unde va ncepe procesul de replicare </p><p> Elongarea cuprinde evenimetele ce se desfoar la o bifurcaie de replicare, unde catenele parentale sunt copiate n catene fiice </p><p> Terminarea este o etap destul de puin cunoscut i se desfoar atunci cnd molecula parenatl a fost complet replicat </p><p> Etapele chimice ale replicrii ADN </p><p>Din punct de vedere chimic, replicarea ADN presupune urmtoarele etape principale: desfacerea iniial a dublului helix ntr-o zon denumit regiune de origine a replicrii sinteza unor fragmente de ARN m.c. scurt ce ofer captul 3-OH liber pentru sinteza primelor </p><p>legturi fosfo-diesterice; aceste fragmente poart numele de primeri i sunt sintetizate de ARN polimeraze speciale denumite primaze </p><p> n bucla de ADN desfcut procesul de replicare se va desfura n ambele direcii, formndu-se deci 2 bifurcaii de replicare </p><p> n faa fiecrei bifurcaii de replicare dublul helix va fi desfcut prin intervenia topoizomerazelor (care dersucesc dublul helix) i a helicazelor (care desfac legturile de hidrogen dintre cele 2 catene); astfel, bucla de replicare se va lrgi n fiecare din cele 2 capete </p><p> fiecare din cele 2 catene ale helixului parental va servi drept matri pentru sinteza unei catene noi sinteza catenelor noi se realizeaz de ctre enzime numite ADN polimeraze, pe baz de </p><p>complementaritate cu catena veche folosit ca matri; nucleotidele sunt legate ntre ele prin formarea de legturi fosfo-diesterice; alungirea catenei noi se realizeaz n direcie 5 3 </p><p> datorit faptul c ADN polimerazele nu pot sintetiza o caten nou dect n direcie 5 3, la fiecare bifurcaie de replicare, sinteza celor 2 catene noi are loc oarecum diferit : </p><p> una din catenele noi este sintetizat continuu, pornind de la un singur primer: aceast caten este denumit catena conductoare (leading) (Figura 4.1) </p><p> cealalt caten este sintetizat discontinuu, pe msur ce dublul helix parental este desfcut n continuare; aceast caten este denumit caten ntrziat (lagging) i este format din multe fragmente distincte, denumite fragmente Okazaki (de la numele celul care le-a descris prima oar) de aproximativ 100 nucleotide; fiecare asemenea fragment este iniiat de la un primer </p><p> ntr-o faz mai avansat a replicrii primerii sunt ndeprtai att din structura catenei conductoare, ct i din cea ntrziat, dup care golurile sunt umplute tot de o ADN polimeraz </p><p> aceste fragmente sunt apoi unite ntre ele prin refacerea legturilor fosfo-diesterice de ctre o ADN ligaz </p><p> 65</p></li><li><p>Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic </p><p> n timpul procesului de replicare monocatenele ADN (att cele vechi, ct i cele nou sintetizate) sunt stabilizate i protejate de aciunea nucleazelor, de ctre o clas special de proteine numite proteine Ssb (Single Stranded Binding) </p><p> terminarea replicrii unei molecule de ADN difer ntre moleculele circulare i cele lineare la moleculele circulare, ntlnite n majoritatea cazurilor la cromozomul bacterian i la plasmide, </p><p>cele 2 bifurcaii de replicare se ntlnesc ntr-o regiune denumit ter. la moleculele ADN lineare din cromozomii de la eucariote, capetele acestora (telomerele) sunt </p><p>replicate printr-un mecanism diferit, iar fragmentele sunt apoi unite de ADN ligaze </p><p>Figura 4.1 Reprezentarea schematizat a unei bifurcaii de replicare. </p><p>Complementaritatea dintre bazele azotate de pe cele 2 catene ale moleculei de ADN determin o structur perfect adaptat funciei de replicare, fiecare dintre cele 2 catene servind drept matri pentru sinteza unei catene complementare. </p><p>In majoritatea cazurilor, replicarea se realizeaz pe model semiconservativ, macromoleculele de ADN fiice fiind formate dintr-o caten veche i una nou (Figura 4.2). </p><p>Figura 4.2 Principalele trei modele de replicare a moleculelor ADN. La majoritatea organismelor (chiar i la genomuri virale) replicarea ADN se desfoar </p><p>bidirecional, ceea ce presupune formarea a dou bifurcaii de replicare ce avanseaz de la secvena de origine a replicrii (denumit secven oriC pentru cromozomul bacterian) ctre regiunea de terminare a replicrii (denumit secvna ter n cromozomul bacterian). </p><p> 66</p></li><li><p>Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic </p><p>Dei procesul de replicare a moleculelor de ADN se desfoar enzimatic n mod similar la toate organismele, att la cele procariote, ct i la cele eucariote, totui exist suficiente diferene ntre cele 2 tipuri principale de organisme. </p><p>Astfel, cromozomul bacterian este un replicon unic, adic are o singur secven de origine a replicrii. n contrast, cromozomii de la eucariote sunt fiecare dintre ei structuri multirepliconice (au mai multe regiuni de origine a replicrii ADN) (Figurile 4.3 i 4.4). </p><p> Figura 4.3 Replicarea bidirecional a unui cromozom bacterian (A) i a unui cromozom de tip eucariot (B) </p><p>Figura 4.4 Reprezentarea schematic a replicrii cromozomului bacterian. </p><p> Mai mult chiar, apar diferene i datorate structurii teriare. Cromozomul bacterian are o </p><p>structur circular i, ca urmare, cele 2 bifurcaii de replicare se ntlnesc la nivelul secvenei ter (Figura 4.5). Cromozomul de tip eucariot are o structur linear, iar capetele lui (denumite telomere) se replic diferit de restul cromozomului. </p><p> Figura 4.5. Imaginea de microscopie electronic i reprezentarea schematizat a unei molecule circulare de ADN n timpul replicrii. </p><p> 67</p></li><li><p>Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic </p><p>4.1.2 Enzimologia replicrii cromozomului bacterian </p><p>Cercetrile asupra procesului de replicare a moleculei ADN precum i asupra enzimelor implicate au debutat pe cromozomul de Escherichia coli i, ca urmare, majoritatea datelor experimentale provin de la bacterii (Figura 4.6). </p><p>4.1.2.1 Complexul primozom Complexul primozom este format dintr-o serie de proteine ce determin iniierea replicrii </p><p>ADN. Cele mai importante proteine sunt: primaza: la bacterii este denumit DnaG i este codificat de gena dnaG; aceast </p><p>enzim sintetizeaz scurte fragmente de ARN ce au funcie de primeri, adic ofer capul 3-OH liber pentru polimerizare. </p><p> proteinele de iniiere: n, n, n, DnaA, DnaB, DnaC i DnaT Iniierea replicrii presupune detaarea secvenei oriC de membrana plasmatic, dup ce, n </p><p>prealabil, a fost atins o anumit mas celular (denumit mas de iniiere) i n urma acumulrii unei cantiti substaniale de fosfolipide acide pe faa intern a membranei plasmatice. </p><p> Secvena oriC din cromozomul de E.coli are 245 bp i prezint 2 regiuni importante: </p><p>- o regiune cu 4 cutii dnaA (sunt formate din cte 9 bp, denumite 9-meri) la care se va ataa proteina DnaA </p><p>- o regiune cu 3 cutii de tip 13-meri, bogate n adenin-timin, la care se vor ataa complexe proteice DnaB-DnaC </p><p>Zece pn la 12 molecule de DnaA se leag la cutiile dnaA, determinnd buclarea moleculei de ADN i, ca atare, desfacerea dublului helix n cutiile dnaB. Zonele monocatenare aprute se complexeaz cu proteina DnaB (cu funcie de helicaz), adus de proteina DnaC. Ulterior, primaza (DnaG) ncepe aici sinteza moleculelor de ARN primeri (Figura 4.7). </p><p>Figura 4.6 Reprezentarea schematic a unei bifurcaii de replicare. </p><p> Figura 4.7 Originea replicrii n cromozomul de E. coli. </p><p> 68</p></li><li><p>Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic </p><p>Figura 4.8 Structura regiunii de origine a replicrii la drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae). (A) Structura secvenei ARS1, o secven ARS tipic de la S.cerevisiae, cu poziionarea secvenelor funcionale A, B1, B2 i B3. Desfacerea dublului helix are loc n regiunea B2 prin ataarea proteinei ABF1 la regiunea B3. Proteinele complexului de origine a replicrii sunt ataate permanent la regiunile A i B1. </p><p> n procesul de replicare a ADN, n diverse etape, apar zone monocatenare ce sunt stabilizate </p><p>(i aprate) fa de aciunea nucleazelor prin ataare de proteine de tip Ssb (Single Stranded Binding proteine ce se ataeaz la monocatene ADN). </p><p>4.1.2.2 Topoizomerazele Superspiralizarea cromzomului bacterian impune intervenia unor enzime care s realizeze </p><p>relaxarea dublului helix ADN. Aceste enzime se numesc topoizomeraze i acioneaz asupra topoizomerilor ADN (Figura 4.9). Topoizomerii sunt molecule ADN cu structur primar i secundar identic i care difer n structura teriar. </p><p>Dou molecule ADN d.c. ce au aceeai secven de nuceotide dar numr diferit de nlnuiri i suporarsuciri sunt topoizomere datorit diferenelor de natur topologic. </p><p>La bacterii, ca de altfel i la eucariote, exist 2 clase de topoizomeraze cu mecanisme diferite de aciune (Figura 4.9) : </p><p> topoizomeraze tip I induc rupturi monocatenare (i tranzitorii) n ADN topoizomeraze tip II induc rupturi bicatenare n ADN (Figura 4.10) </p><p>La bacterii, topoizomeraza de tip I cea mai bine caracterizat este TopA de la E.coli, care relaxeaz suprarsuciri negative nalt rsucite. Topoizomerazele de tip II, n absena ATP, au rolul de a relaxa macromolecula ADN ca i TopA, n timp ce n prezena ATP induc suprarsuciri negative n moleculele circular covalent nchise (CCC) relaxate. Cea mai cunoscut enzim din aceast clas este ADN giraza, care poate introduce aproximativ 100 de suprarsuciri negative per minut. </p><p>Figura 4.9 Desfacerea dublului helix ntr-o bifurcaie de replicare, prin aciunea topoizomerazelor. </p><p> 69</p></li><li><p>Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic </p><p>Figura 4.10 Modul de aciune al ADN topoizomerazelor de tip I i II. (A) Topoizomerazele de tip I realizeaz ruperi monocatenare, conduc catena intact prin aceast rupere, refcnd apoi legtura fosfo-diesteric. (B) Topoizomerazele de tip II taie ambele catene dintr-un dublu helix; prin acest </p><p>spaiu este trecut un alt fragment al dublului helix, iar apoi se refac cele 2 legturi fosfo-diesterice. </p><p>Figura 4.11 Rolul secvenelor terminator i al proteinelor Tus n replicarea cromozomului la E.coli. </p><p>4.1.2.3 ADN polimeraze Procesul de replicare propriu-zis a ADN este realizat de un complex de enzime denumite </p><p>ADN polimeraze. Cea mai important activitate enzimatic desfurat de o asemenea enzim este formarea de legturi fosfo-diesterice ntre nucleotide adiacente, cu creterea lanului n direcie 5 3. </p><p>Toate ADN polimerazele descrise pn n prezent polimerizeaz n direcie 5 3 i nu pot realiza acest proces dect pornind de la capul 3OH liber al unei nucleotide. De obicei, acest cap este oferit de un scurt fragment monocatenar de ARN denumit primer. La bacterii au fost descrise 3 tipuri de ADN polimeraze ce coexist n aceeai celul: </p><p> 70</p></li><li><p>Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic </p><p>ADN polimeraza I (ADN pol I) este codificat de gena polA i are o g.m. de aprox 100 Md. n celula de E.coli exist circa 400 molecule de ADN pol I care are o vitez de polimerizare de 667 nucleotide / min. n afar de activitatea de polimerizare, aceast enzim poate desfura i activitate de exonucleaz (adic de desfacere de legturi fosfo-diesterice i eliminare de nucleotide dintr-o caten). Astfel, ADN pol I are un domeniu polipeptidic ce realizeaz activitate exonucleazic n direcie 3 5 , activitate foarte important ce i asigur enzimei i posibilitatea de a i corecta singur eventualele erori de ncorporare a unor nucleotide mperecheate greit. Aceast funcie este denumit citire corect (proof-reading). Totodat, ADN pol I poate desfura i activitate exonucleazic n direcie 5 3, activitate ce i permite ndeprtarea primerilor ARN. </p><p>ADN polimeraza II (ADN pol II) este codificat de gena polB. i aceast enzim poate avea i activitate exonucleazic 5 3. </p><p>ADN polimeraza III (ADN pol III) este principala replicaza a cromozomului bacterian i reprezint un adevrat complex enzimatic format din cel puin 10 subuniti funcionale (Tabelul din Figura 4.12). </p><p>Figura 4.12 Subunitile ADN polimerazei III de la procariote. Denumirea subunitii </p><p>Masa molecular </p><p>Gena Funcii Subansamblu </p><p> 130 pol C (dnaC) ADN pol Exo 5 3 27 dnaQ Exo 3 5 10 holE structural </p><p> Miezul enzimei </p><p> 71 dnaXZ Dimerizarea miezului </p><p>enzimei complexul </p><p> 47 dnaXZ 35 holA 33 holB 15 holC 12 holD </p><p>ATPaze complexul favorizeaz transferul sub. la matria ADN </p><p> 40 dnaN Leag miezul enzimei la ADN i l recicleaz </p><p>complexul </p><p> Holoenzima ADN pol III acioneaz ca dimer, fiecare din cei 2 monomeri realiznd sinteza pe </p><p>una din cele 2 catene. O excepie o reprezint complexul care acioneaz doar pe catena ntrziat. </p><p>Figura 4.13 Reprezentarea schematizat a interveniei subunitilor ADN polimerazei la eucariote. </p><p> 71</p></li><li><p>Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic </p><p>4.1.3 Replicarea plasmidelor bacteriene Indiferent dac confer bacteriei gazd caractere eseniale sau neeseniale, toate plasmidele au </p><p>n structura lor o regiune foarte important pentru replicarea i meninerea stabil a plasmidului respectiv n populaia bacterian. n prezent se consider c aceast regiune esenial ar conine: </p><p>a) secvene de origine a replicrii plasmidiale, denumite convenional oriV (fata de oriC - originea replicrii cromozomului bacterian); o secven oriV trebuie s indeplineasca urmatoarele conditii: </p><p>- regiunea ADN minimal, cu activitate n cis, ce poate sustine replicarea plasmidial - regiunea ADN n care cele 2 catene se despart pentru a iniia procesul de replicare - nucleotidul/nucleotidele la care incepe sinteza catenei leading b) multe plasmide codific o protein implicat n iniierea replicrii plasmidiale, </p><p>denumita proteina de tip Rep c) gene implicate n controlul replicrii plasmidiale </p><p>4.1.3.1 Replicarea plasmidelor lineare (ADN d.c. linear) </p><p>n ceea ce privete replicarea plasmidelor lineare, aceasta se desfoar prin mecanisme diferite funcie de tipul de telomere. </p><p>a) plasmide cu telomere hairpin Datorit capetelor legate covalent, ADN polimeraza poate trece peste ele continund </p><p>replicarea printr-un intermediar replicativ concatemeric. Asemenea plasmide ar putea reprezenta un caz special de plasmide circulare monocatenare, n care jumtate din cerc este complementar cu cealalt jumtate. </p><p> b) plasmide cu telomere invertroni </p><p>se replic printr-un mecanism de replicare ADN primat de proteine, n cazul de fa proteina TP (Telomeric Protein). n cazul unor asemenea plasmide, telomerele reprezint originea replicrii i sunt recunoscute de proteine de iniiere care desfac dublul helix ADN. Plasmidele cu telomere invertroni sunt replicate de o ADN polimeraz ce seamn mai mult cu ADN polimeraza de la eucariote, dect cu ADN polimerazele de la procariote. </p><p>Ultima nucleotid de la capul 5 al fiecarei din cele 2 catene (nucleotida la care este ataat covalent proteina TP), este o adenin (A). Separat de molecula plasmidial, se formeaz complexe din alt monomer TP i alt molecul de adenin. Cei 2 monomeri TP (unul ataat la o...</p></li></ul>