Chemia żywności Katedra Analizy Środowiska ?· Chemia żywności Katedra Analizy Środowiska Instrukcja…

  • Published on
    27-Feb-2019

  • View
    212

  • Download
    0

Embed Size (px)

Transcript

1

Uniwersytet Gdaski Wydzia Chemii

Chemia ywnoci Katedra Analizy rodowiska

Instrukcja do wicze laboratoryjnych

Waciwoci fizykochemiczne biaek mleka kazeiny

Chemia ywnoci

wiczenie nr 3

Gdask, 2016

3. Waciwoci fizykochemiczne biaek mleka kazeiny

2

1. CZ TEORETYCZNA

Biaka s naturalnymi produktami zbudowanymi z reszt -L-aminokwasowych, poczonych

w acuchy polipeptydowe wizaniami trans-peptydowymi (jedynie przed kad reszt proliny

wystpuje konfiguracja cis). Budowa i waciwoci biaek, w tym biaek obecnych w mleku,

opisane s w pozycji 2 i 3 spisu literatury. Najistotniejsze informacje niezbdne do wyjanienia

przeprowadzonych procesw/reakcji podano poniej.

1. 1. Struktura i waciwoci fizykochemiczne biaek

Struktura pierwszo-, drugo-, trzecio- i czwartorzdowa

Rnorodno biaek wynika ze skadu i sposobu uszeregowania reszt rnych aminokwasw

w czsteczce (struktury pierwszorzdowej). Chemiczne waciwoci i wymiary reszt aminokwasw

powizanych w okrelonej sekwencji decyduj o konformacji biaek (ksztacie acuchw

polipeptydowych - strukturze drugorzdowej), o ich przestrzennym uoeniu w czsteczce

(strukturze trzeciorzdowej), a take o wzajemnym oddziaywaniu podjednostek przy tworzeniu

struktur czwartorzdowych. Biaka o okrelonej konformacji maj charakterystyczne waciwoci

biologiczne oraz cechy funkcjonalne w ywnoci.

Denaturacja

Pod wpywem wielu czynnikw fizycznych i chemicznych nastpuje nieodwracalne zniszczenie

struktury biaka zwane procesem denaturacji. Denaturacja biaka dotyczy zmian w II, III- i IV-

rzdowej strukturze biaka natywnego, ktre prowadz do utraty aktywnoci biologicznej lub innej

indywidualnej cechy charakterystycznej przy zachowaniu jego struktury pierwszorzdowej.

Podczas denaturacji niszczone s wizania wodorowe, a w obecnoci odczynnikw redukujcych

zerwaniu ulegaj wizania disulfidowe. Denaturacja moe by procesem odwracalnym

(tzw. renaturacja) lub nieodwracalnym. Podczas denaturacji zachodz zmiany rozpuszczalnoci

i przesunicie punktu izoelektrycznego. Rozwinicie acucha peptydowego moe prowadzi

do wzrostu lepkoci, a take zmian absorpcji w nadfiolecie. Obserwuje si rwnie czsto procesy

agregacji i wytrcania, co jest zwizane ze zmianami stopnia hydratacji i rozpuszczalnoci biaek.

Najwaniejszymi metodami fizycznymi denaturacji s: ogrzewanie, silne mieszanie, wytrzsanie,

nawietlanie promieniowaniem nadfioletowym, rentgenowskim i jonizujcym lub dziaanie

ultradwikami. Denaturacja chemiczna zachodzi pod wpywem zwizkw, ktre s zdolne

do rozerwania wiza wodorowych, na przykad pod wpywem roztworu mocznika o steniu

6-8 mol/l lub chlorku guanidyny o steniu 4 mol/l, na skutek dziaania kwasw lub zasad (warto

3. Waciwoci fizykochemiczne biaek mleka kazeiny

3

pH poniej 3 lub powyej 9), soli metali cikich, a take 1% roztworu dodecylosiarczanu sodu

(SDS).

Rozpuszczalno w wodzie

Biaka na og s rozpuszczalne w wodzie. Niektre z nich mog rozpuszcza si w rozcieczonych

kwasach lub zasadach, jeszcze inne w rozpuszczalnikach organicznych. Posiadaj zdolno

wizania czsteczek wody. Efekt ten nazywamy hydratacj. Pocztkowo pczniej, a nastpnie

rozpuszczaj si tworzc czstki koloidalne.

Biaka ulegaj procesowi koagulacji i procesowi odwrotnemu - peptyzacji. Koagulacja jest to

przejcie zolu w el, a peptyzacja jest to przejcie elu w zol.

Na rozpuszczalno biaek ma te wpyw stenie soli nieorganicznych. Ich mae stenie wpywa

dodatnio na rozpuszczalno polipeptydw, jednak przy pewnym steniu nastpuje uszkodzenie

otoczki solwatacyjnej, co powoduje wypadanie biaek. Proces ten nie narusza struktury biaka, jest

odwracalny i nosi nazw wysalania biaek.

Odczyn biaka / punkt izoelektryczny

Podstawowe struktury aminokwasw tworzcych biako zawieraj rne grupy funkcyjne -

kwasowe, zasadowe, piercienie aromatyczne, grupy alkoholowe, atomy siarki itp., std

w zalenoci od pH roztworu, w jakim si znajduj przybieraj - jako cao - adunek ujemny lub

dodatni. adunek czsteczki biaka w roztworze o okrelonym steniu jonw wodorowych zaley

od ilociowego stosunku aminokwasw zasadowych (lizyny, histydyny i argininy) i aminokwasw

kwasowych (kwasu glutaminowego i asparaginowego). Od sumarycznego adunku czsteczki

zaley z kolei jej stabilno w rodowisku o rnym pH. W rodowisku o wysokim steniu jonw

wodorowych (niskie pH) czsteczka biaka zyskuje adunek dodatni, podczas gdy w rodowisku

o niskim steniu jonw wodorowych (wysokie pH) ma adunek ujemny. Warto pH, przy ktrym

sumaryczny adunek czsteczki wynosi 0, nosi nazw punktu izoelektrycznego. W punkcie

izoelektrycznym biako nie wykazuje ruchliwoci elektroforetycznej oraz charakteryzuje si

najnisz rozpuszczalnoci w wodzie.

Wysalanie biaek

Wysalaniem biaek, jak wspomniano, nazywamy proces wytrcenia z roztworu biaek

rozpuszczalnych w wodzie przez wysokie stenie soli. Stosuje si w tym celu sole, ktrych jony

atwo tworz wodziany. Zjawisku wysalania sprzyjaj te aniony, ktre tworz wizania wodorowe

3. Waciwoci fizykochemiczne biaek mleka kazeiny

4

lub maj du elektroujemno. Elektrolity wielowartociowe dziaaj silniej

od jednowartociowych. Sole wice wod pozbawiaj biaka paszcza wodnego, sprzyjajc ich

asocjacji w wiksze agregaty o zmniejszonej rozpuszczalnoci, ktre wypadaj z roztworu. Stenie

soli potrzebne do wysalania biaek zaley od ich waciwoci oraz pH rodowiska. Najatwiej

wysoli biako w jego punkcie izoelektrycznym, poniewa czsteczki na zewntrz obojtne atwo

asocjuj w wiksze agregaty wypadajce z roztworu. Do wysalania najczciej stosuje si

(NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4.

Wysalanie biaek jest procesem odwracalnym, usunicie soli, np. przez dializ, sprawia,

e wytrcone biako ponownie rozpuszcza si i wykazuje swe biologiczne waciwoci.

1.2. Skad chemiczny mleka

Mleko to pynna wydzielina wyspecjalizowanych gruczow ssakw suca jako pokarm dla

modych osobnikw. Skad mleka rnych gatunkw zwierzt rni si do znacznie i zosta

szczegowo opisany w pozycji 2 spisu literatury. Mniejsze rnice w skadzie wystpuj midzy

poszczeglnymi rasami i osobnikami. Jest ono rdem wysokowartociowych biaek, atwo

przyswajalnego tuszczu, soli mineralnych (w tym wapnia, fosforu, potasu) oraz witamin

rozpuszczalnych w tuszczach (A, D, E, K) i w wodzie (z grupy B). Mleko niektrych ssakw nie

nadaje si do bezporedniej konsumpcji przez czowieka, np. mleko fok zawiera 12 razy wicej

tuszczu, a take wicej biaka ni mleko krowie. Istotnym skadnikiem mleka jest laktoza -

disacharyd nadajcy mleku charakterystyczny sodkawy posmak.

Najczciej wykorzystywanym przez czowieka jako produkt spoywczy jest mleko krowie. Skad

chemiczny mleka krowiego zaley od wielu czynnikw, jak np. paszy, rasy i wieku zwierzcia itp.

Wystpuj w nim rne skadniki (Tabeli 1), m.in. substancje mineralne: wap, fosfor, magnez,

chlor, potas, siarka, elazo i jod. Zwizki mineralne znajduj si w iloci okoo 0,7%.

Tabela 1. Skad mleka krowiego (http://www.nutrilife.pl/index.php?art=25)

Substancja Mleko krowie

Biako 3,3 - 4,3 g/100 ml

Tuszcze 3,9-5,7 g/100 ml

Cukier laktoza 4,5-4,9 g/100 ml

Fosfor 30,7 mmol/l

Wap 30,11 mmol/l

Ilo kcal/100 ml 61-66 kcal

pH 6,6

Sucha masa 12,6-15,4 g/100 ml

3. Waciwoci fizykochemiczne biaek mleka kazeiny

5

Biaka mleka nale do biaek penowartociowych o wysokiej wartoci biologicznej, zawieraj

bowiem wszystkie aminokwasy egzogenne niezbdne do budowy biaka ustrojowego oraz wzrostu

czowieka. Pod tym wzgldem ustpuj jedynie biaku jaja kurzego, bdcego dietetycznym

wzorcem. Doskonale uzupenia produkty rolinne, jak pieczywo, kasze, mki, warzywa, ktre

zawieraj biako niepenowartociowe. Warto energetyczna (kaloryczna) mleka - w zalenoci od

zawartoci tuszczu wynosi okoo 500 -700 kcal/kg i pokrywa ok. 25% przecitnego dziennego

zapotrzebowania czowieka na energi. Jest wic to produkt stosunkowo niskokaloryczny, przy

duej zawartoci biaka.

Biaka mleka dzieli si ze wzgldu na ich budow, rol biologiczn i waciwoci funkcjonalne na

kazeiny, biaka serwatki oraz otoczki kuleczek tuszczowych (Tabela 2).

Tabela 2 Zawarto biaek w mleku krowim (http://www.food-info.net/pl/qa/qa-fp1.htm).

Biako g/kg biaka Udzia w cakowitej zawartoci biaka

Kazeina

-s1-kazeina 10.0 30.6

-s2-kazeina 2.6 8.0

-kazeina 10.1 30.8

-kazeina 3.3 10.1

Cakowita zawarto kazeiny 26.0 79.5

Biaka serwatki

-laktoalbumina 1.2 3.7

-laktoglobulina 3.2 9.8

Albumina surowicy krwi 0.4 1.2

Immunoglobuliny 0.7 2.1

Pozostae 0.8 2.4

Cakowita zawarto biaek

serwatki

6.3 19.3

Kuleczki tuszczowe 0.4 1.2

Cakowita zawarto biaka 32.7 100

Kazeiny s heterogeniczn grup fosfoprotein, zoon z 20 skadnikw; s to najwaniejsze biaka

mleka krowiego, jego zawarto wynosi 2,4-2,6%. W mleku krowim 40% kazeiny stanowi frakcja

, 30% frakcja , a dalsze 10% frakcja . Kazeiny strcaj si z surowego, odtuszczonego mleka w

temp. 20C przy pH 4,6; w mleku wystpuj w postaci miceli tworzcych roztwr koloidalny.

Kuliste micele maj ksztat maliny (rednica 20-300 nm), a ich masa micelarna wynosi 107-1010.

Micele posiadaj porowat struktur i s wyranie widoczne pod mikroskopem; czstki miceli

wypeniaj mniej ni poow jej objtoci. Taka budowa sprzyja wizaniu wody, jonw, laktozy i

enzymw. W 1 ml mleka jest okoo 71013 miceli, ktre stanowi cznie od 5 do 6% objtoci

mleka. Micele utworzone s z podjednostek zoonych z 25-30 czsteczek kazeiny , , , ktrych

domeny hydrofobowe s zwrcone do wntrza, a hydrofilowe w kierunku rozpuszczalnika (Rys. 1).

Podjednostki te, podobnie jak micele, maj budow sferyczn, a ich rednica nie przekracza

3. Waciwoci fizykochemiczne biaek mleka kazeiny

6

10-20 nm.

Rysunek 1. Struktura miceli kazeinowej

W miceli podjednostki poczone s mostkami utworzonymi przy jony wapniowe, fosforanowe i

cytrynianowe:

biako Ca2+ biako

biako Ca2+ HPO42 Ca2+ biako

biako Ca2+ H-cytrynian2- HPO42 Ca2+ biako

Niecaa kazeina wystpuje w mleku w postaci micelarnej, czyli kompleksu fosforokazeinowego.

Pewna jej cz (do 8 -10%) stanowi tzw. kazein rozpuszczaln, ktra wystpuje w postaci

pojedynczych czsteczek. Pomidzy kazein czsteczkow i micelarn istnieje stan rwnowagi,

zaleny od stenia jonw wapnia- Wzrost stenia jonw wapniowych przesuwa rwnowag w

kierunku postaci micelarnej, natomiast gdy stenie jonw wapniowych maleje, nastpuje

dysocjacja miceli.

Micele kazeinowe, w wieym mleku przy pH ok. 6,6 maj ujemny adunek elektryczny, czyli

wystpuje przewaga zdysocjowanych grup kwasowych nad zasadowymi. Warunkuje to tworzenie

si wok miceli warstw hydratacyjnych o jednoimiennych adunkach. Warstwy te odpychaj si,

stabilizujc roztwr koloidalny kazeiny.

Micele kazeinowe cechuje wysoka stabilno podczas ogrzewania wieego mleka koagulacj

ciepln powoduje dopiero dugotrwae ogrzewanie w temp. ponad 100C. Proces koagulacji kazeiny

w mleku mona wywoa take wieloma innymi czynnikami:

Poprzez zakwaszenie mleka do punktu izoelektrycznego, w ktrym ilo zdysocjowanych

grup kwasowych i zasadowych w micelach kazeiny jest jednakowa (w wieym mleku

3. Waciwoci fizykochemiczne biaek mleka kazeiny

7

w temp. 20C odpowiada wartoci pH 4,6). Zakwaszenie mleka moe by osignite

w wyniku fermentacji mlekowej laktozy, ktra podczas duszego przechowywania mleka

pod wpywem bakterii kwasu mlekowego przeksztaca si w kwas mlekowy. Bezporednie

dodanie do mleka kwasu mlekowego, siarkowego (VI) czy octowego rwnie powoduje

koagulacj kwasow kazeiny.

Dodatek soli metali, takich jak FeCl3, PG(CH3COO)2, lub wprowadzenie do mleka

znacznych iloci soli dysocjujcych, np. (NH4)2SO4, NaCl, CaCl2. Powoduje si wwczas

koagulacj przez wysalanie.

Dziaajc na mleko enzymami, np. podpuszczk, chymozyn czy pepsyn. Wytrcanie

kazeiny zachodzi na drodze koagulacji enzymatycznej.

Nie wszystkie wymienione metody prowadz do selektywnego wydzielenia kazeiny. Czsto temu

procesowi towarzyszy wytrcanie si pozostaych biae mleka, np. ogrzewanie mleka w temp. 80C

z wodnym roztworem CaCl2 pozwala na wytrcenie 90% biaek zawartych w mleku w postaci

obfitego skrzepu.

Mechanizm kwasowej koagulacji kazeiny mona przedstawi w nastpujcy sposb. Przy

pH mleka ok. 6,65 oglny adunek elektryczny miceli kazeinowych jest ujemny. Otoczone s wic

czsteczkami wody przy czym bieguny dodatnie jej dipoli zwrcone s w kierunku miceli, a ujemne

na zewntrz. W ten sposb micele otoczone zostaj warstw hydratacyjn o jednoimiennym

zewntrznym adunku elektrycznym i dlatego wzajemnie odpychaj si, co stabilizuje roztwr

koloidalny kazeiny, a warstwa hydratacyjna uniemoliwia take bezporedni kontakt midzy

micelami. Stopie hydratacji miceli zaleny jest m.in. od wartoci ich adunku elektrycznego,

Stopie jonizacji tych grup zmienia si przy zmianach wartoci pH rodowiska. Dodawanie

do mleka kwasu octowego do momentu osignicia punktu izoelektrycznego, powoduje utrat

przez micele zdolnoci wizania wody, a zatem warstwy hydratacyjne. Siy odpychania miedzy

micelami zanikaj, nastpuje wzajemne zblienie si w agregaty z wytworzeniem elu.

Mechanizm koagulacji enzymatycznej kazeiny oparty jest na odczeniu hydrofilowych

fragmentw submicel. Po zewntrznej czci miceli kazeinowej znajduj si submicele, ktre

charakteryzuj si sferycznym nagromadzeniem hydrofilowej frakcji -kazeiny (Rys. 1). Skrzep

podpuszczkowy powstaje w wyniku odczenia przez enzym proteolityczny (podpuszczk)

fragmentu -kazeiny. Od miceli odczany jest fragment o silnych waciwociach hydrofilowych,

fragment ten okrelany jest jako glikomakropeptyd. Fragment -kazeiny, ktry pozosta

3. Waciwoci fizykochemiczne biaek mleka kazeiny

8

w submiceli (okrelany jako para--kazeina) nie posiada waciwoci hydrofilowych. W ten sposb

micele kazeinowe, po stracie fragmentw hydrofilowych, w efekcie oddziaywa hydrofobowych,

cz si ze sob dodatkowo tworzc mostki wapniowe. Liczba mostkw warunkuje zwizo

skrzepu, za zwikszenie oddziaywa hydrofobowych (zwizane ze stopniowym traceniem

czsteczek glikomakropeptydu) przyczynia si do separacji serwatki od masy serowej.

Na stabilno skrzepu wpywa efektywno enzymatycznego odszczepiania hydrofilowej frakcji

-kazeiny (glikomakropeptydu) oraz skuteczno tworze...

Recommended

View more >