COLORAÇÃO DE GRAM E DE ZIEHL

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    13-Dec-2015

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COLORAO DE GRAM E DE ZIEHL

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<p>COLORAO DE GRAM E DE ZIEHL-NEELSENTexto 1. A Coloracao de Gram e as Variacoes na sua Execucao</p> <p>RESUMOA coloracao de Gram e um importante teste realizado nos laboratorios de microbiologia, sendo um recurso auxiliar no diagnostico de doencas bacterianas. A partir de um determinado perfil tintorial as bacterias coram-se de roxo ou de rosa e consequentemente sao classificadas como Gram-positivas ou Gram-negativas, respectivamente. A coloracao de Gram envolve uma serie de procedimentos antes de chegar a etapa final de leitura da lamina preparada: envolve a confeccao do esfregaco, sua fixacao e passa pela coloracao pro- priamente. Nesta, o corante Cristal Violeta adsorve-se nas celulas, forma um complexo com o iodo (Lugol) e apos a etapa diferencial, com alcool-acetona, as celulas sao contra-coradas com Fucsina de Gram. Neste estudo avaliou-se a influencia de variacoes na referida coloracao considerando os tempos de exposicao aos corantes Cristal Violeta e a Fucsina de Gram e o emprego ou nao de lavagens com agua entre as etapas. Os resultados obtidos mostraram que as diferencas nos procedimentos aplicados em cada tecnica testada nao alteraram o resultado quando comparados a laminas padrao.INTRODUOEm geral, so necessrias coloraes biolgicas para a visualizao de bactrias de modo adequado e demonstrao dos detalhes finos das suas estruturas.</p> <p>O advento da colorao representa, em grande parte, o fundamento dos principais avanos produzidos em microbiologia clnica e em outros campos da microscopia diagnstica durante os ltimos 100 anos.</p> <p>A maioria das coloraes utilizadas em bacteriologia tem por finalidade o diagnstico presuntivo rpido do processo infeccioso e tambm a prvia avaliao da qualidade da amostra.</p> <p>A colorao de Gram o mtodo bacterioscpico mais importante e mais utilizado atualmente na bacteriologia e sua finalidade a classificao de microrganismos com base em suas caractersticas tintoriais, tamanho, forma e arranjo celular.</p> <p>As bactrias so classificadas basicamente em dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas. No que diz respeito s caractersticas tintoriais, as bactrias Gram-positivas coram-se de roxo e as bactrias Gram-negativas coram-se de rosa.</p> <p>A deteco de microrganismos na amostra de suma importncia, uma vez que pode indicar uma terapia antimicrobiana direcionada a um determinado grupo de patgenos e, tambm, a necessidade da realizao de cultura com finalidade diagnstica e/ou epidemiolgica.</p> <p>A tcnica de colorao de Gram geralmente respeita um protocolo de aes que a padroniza. Contudo, ha variantes nesse procedimento relacionadas aos tempos de execucao da coloracao e a utilizacao de lavagem com agua em dadas etapas que podem ou nao interferir na visualizacao das estruturas coradas. Nesse sentido, este trabalho se propos a verificar se estas pequenas variacoes de tempo e lavagens a partir de protocolos especificos refletem em alguma alteracao na interpretacao dos resultados da coloracao de Gram. </p> <p>FREITAS, Valdonir da Rosa; PICOLI, Simone Ulrich. A colorao de Gram e as variaes na sua execuo. Newslab, v. 82, p. 124-128, 2007.</p> <p>Texto 2. Tcnica de Colorao de GRAM</p> <p>INTRODUOO metodo tintorial predominante utilizado em bacteriologia e o metodo de Gram. A bacterioscopia, apos coloracao pelo metodo de Gram com diagnostico presuntivo, de triagem, ou ate mesmo confirmatorio em alguns casos, constitui peca importante e fundamental na erradicacao e no controle das Doencas Sexualmente Transmissiveis (DST). Essa tecnica e simples, rapida e tem capacidade de resolucao, permitindo o correto diagnostico em cerca de 80% dos pacientes em carater de pronto atendimento em nivel local. Os custos com investimento e manutencao sao consideravelmente baixos diante da eficacia alcancada com os resultados imediatos dos testes. Essa tecnica requer instalacao simples, necessitando apenas de uma sala pequena com disponibilidade de agua e gas, onde devera ser instalado um balcao com pia e um bico de Busen, eventualmente substituido por uma lamparina ou espiriteira. Sao ainda necessarios: microscopio com objetiva de imersao e bateria para a coloracao de Gram. Os corantes devem ser preparados pelo proprio laboratorio ou por um laboratorio habitado que assegure a qualidade do produto. Finalmente, e mais importante, sao necessarios tecnicos de laboratorio treinados, responsaveis e conscientes do valor do seu trabalho. A coloracao de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o medico dinamarques Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bacterias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classifica-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram- positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas. Apos descricao do metodo, inumeras propostas de modificacao foram feitas. Neste manual, voce vai conhecer a tecnica, os corantes e os procedimentos para a correta realizacao da coloracao de Gram, recomendados pelo Programa Nacional de Doencas Sexualmente Transmissiveis e Aids do Ministerio da Saude. </p> <p>Como funciona a coloracao de Gram? Desde o trabalho original de Hans Gram, varios pesquisadores tentaram, com pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no metodo de coloracao. Conceitos diversos tem sido apresentados, tais como: 1. A existencia de um substrato Gram-positivo e especifico;2.As bacterias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam diferentes afinidades com o corante primario cristal de violeta; e 3.A existencia de diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos. Este ultimo e o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da pare- de celular, quanto as dimensoes dos espacos intersticiais, por exemplo, diametro do poro, parecem ser determinantes do resultado final da coloracao de Gram. Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares sao cobertas pela violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adicao do lugol, tambem chamado de mordente, ocorre a formacao do completo iodo-pararosanilina. Esta reacao tem a propriedade de fixar o corante primario nas estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como alcool etilico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou nao perdem a cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas. As bacterias que tem a parede celular composta por mureina (peptideoglicano - peptideo de acido n-acetil muramico), durante o proces- so de descoloracao com alcool etilico, retem o corante. Ja as bacterias com parede celular composta predominantemente por acidos graxos (lipopolissacarideos e lipoproteinas) perdem o complexo iodo-pararosanilina, assumindo a cor do corante de fundo. Brasilia: Ministrio da Sade, Tcnica de Coloraao de Gram. Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e AIDS, 1997. 63 p.: iI. (Srie TELELAB) 1. Gram I. Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e AIDS, (Brasil). II. Srie TELELAB. Disponvel em: http://www.newslab.com.br/ed_anteriores/82/art02/art02.pdf. Acesso em: 15 out 2014.</p> <p>TEXTO 3. Colorao de Gram e cido Resistente (Tortora)</p> <p>A colorao de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologis- ta dinamarqus Hans Christian Gram. Ela um dos procedimentos de colorao mais teis, pois classifica as bactrias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas.Neste procedimento (Figura 3.12a),1. Um esfregao fixado pelo calor recoberto com um corante bsico prpura, geralmente o cristal violeta. Uma vez que a colorao prpura impregna todas as clulas, ela denominada colorao primria.2. Aps um curto perodo de tempo, o corante prpura lavado, e o esfregao recoberto com iodo, um mordente. Quando o iodo lavado, ambas as bactrias gram-positivas e gram-negativas aparecem em cor violeta escuro ou prpura.3. A seguir, a lmina lavada com lcool ou uma soluo de lcool-acetona. Essa soluo um agente descolorante, que remove o prpura das clulas de algumas espcies, mas no de outras.4. O lcool lavado, e a lmina ento corada com safranina, um corante bsico vermelho. O esfregao lavado novamente, seco com papel e examinado microscopicamente.O corante prpura e o iodo se combinam no citoplasma de cada bactria, corando-a de violeta escuro ou prpura. As bact- rias que retm essa cor aps a tentativa de descolori-las com lcool so classificadas como gram-positivas; as bactrias que perdem a cor violeta escuro ou prpura aps a descolorao so classificadas como gram-negativas (Figura 3.12b). Como as bactrias gram- -negativas so incolores aps a lavagem com lcool, elas no so mais visveis. por isso que o corante bsico safranina aplica- do; ele cora a bactrias gram-negativas de rosa. Os corantes como a safranina, que possuem uma cor contrastante com a colorao primria, so denominados contracorantes. Como as bactrias gram-positivas retm a cor prpura original, no so afetadas pelo contracorante safranina.Os diferentes tipos de bactrias reagem de modo distinto colorao de Gram, pois diferenas es- truturais em suas paredes celulares afetam a reteno ou a liberao de uma combinao de cristal violeta e iodo, denominada comple- xo cristal violeta-iodo (CV-I). Entre outras diferenas, as bactrias gram-positivas possuem uma parede celular de peptideoglicano mais espessa (dissacardeos e aminocidos) que as bactrias gram- -negativas. Alm disso, as bactrias gram-negativas contm uma camada de lipopolissacardeo (lipdios e polissacardeos) como parte de sua parede celular (veja a Figura 4.13, pgina 86). Quando aplicados a clulas gram-positivas e gram-negativas, o cristal vio- leta e o iodo penetram facilmente nas clulas. Dentro das mesmas, o cristal violeta e o iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo maior que a molcula de cristal violeta que penetrou na clula e, devido a seu tamanho, no pode ser removido da camada intacta de peptideoglicano das clulas gram-positivas pelo lcool. Consequentemente, as clulas gram-positivas retm a cor do co- rante cristal violeta. Nas clulas gram-negativas, contudo, a lava- gem com lcool rompe a camada externa de lipopolissacardeo, e o complexo CV-I removido atravs da camada delgada de peptide- oglicano. Como resultado, as clulas gram-negativas permanecem incolores at serem contracoradas com a safranina, quando adqui- rem a cor rosa.Em resumo, as clulas gram-positivas retm o corante e permanecem com a cor prpura. As clulas gram-negativas no retm o corante; elas ficam incolores at serem contracoradas com um corante vermelho.O mtodo de Gram uma das mais importantes tcnicas de colorao na microbiologia mdica. Porm, os resultados da co- lorao de Gram no so universalmente aplicveis, pois algumas clulas bacterianas coram-se fracamente ou no adquirem cor. A reao de Gram mais consistente quando utilizada em bactrias jovens, em crescimento.</p> <p>Figura 1. Procedimento para a realizao da colorao de Gram.</p> <p>Figura 2. Micrografia de bactrias coradas pelo Gram. Os bastonetes e os cocos (roxo) so gram-positivos, e os vibries (rosa) so gram-negativos. Colorao lcool-cido resistenteOutra importante colorao diferencial (que classifica as bactrias em grupos distintos) a colorao lcool-cido resistente, que se liga fortemente apenas a bactrias que possuem material creo em suas paredes celulares. Os microbiologistas utilizam essa colorao para identificar todas as bactrias do gnero Mycobacterium, incluindo os dois importantes patgenos Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose, e Mycobacterium leprae, o agente causador da lepra. Essa colorao tambm usada para identificar as linhagens patognicas do gnero Nocardia. As bactrias dos gneros Mycobacterium e Nocardia so lcool-cido resistentes.No procedimento de colorao lcool-cido resistente, o corante vermelho carbolfucsina aplicado a um esfregao fixado, e a lmina aquecida levemente por vrios minutos. (O calor aumenta a penetrao e a reteno do corante.) A seguir, a lmina resfriada e lavada com gua. O esfregao tratado com lcool-cido, um descolorante, que remove o corante vermelho das bactrias que no so lcool-cido resistentes. Os microrganismos lcool-cido resistentes retm a cor vermelha, pois a carbol-fucsina mais solvel nos lipdios da parede celular que no lcool-cido. Em bactrias que no so lcool-cido resistentes, cujas paredes celulares no possuem os componentes lipdicos, a carbolfucsina rapidamente removida durante a desco- lorao, deixando as clulas incolores. O esfregao ento corado com o contracorante azul de metileno. As clulas que no so lco- ol-cido resistentes ficam azuis aps a aplicao do contracorante.</p> <p>Figura 3. Bactrias lcool-cido resistentes (BAAR). As bactrias Mycobacterium leprae que infectaram este tecido foram coradas de vermelho com uma colorao lcool-cido. As clulas que no so lcool-cido resistentes esto coradas com o contracorante azul de metileno.</p> <p>TORTORA, Gerard J; FUNKE, Berdell R; CASE, Christine L. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2012. 934 p. Traduo: Aristbolo Mendes da Silva [et al.]; reviso tcnica: Flvio Guimares da Fonseca.</p> <p>TEXTO 4. Colorao de Gram e Zhiel-Neelsen Prticas de Microbiologia</p> <p>COLORAO DE GRAM</p> <p>Foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista Hans Christian Gram e a colorao diferencial mais utilizada em bacteriologia. Esta colorao separa as bactrias em dois grandes grupos: as Gram-positivas (Gram +) e as Gram-negativas (Gram -). Este mtodo de colorao o mtodo de escolha para a identificao de bactrias, porm deve der utilizado em bactrias em fase de crescimento. A observao de material coletado corado pela tcnica de Gram no s importante para acompanhar o isolamento de amostras, como tambm para determinar o tipo de antibitico que deve ser utilizado em diferentes infeces. </p> <p>Neste tipo de colorao so utilizados 4 reagentes diferentes, como ser descrito a seguir. O preparo das amostras rpido e se inicia com a colorao de um esfregao de clulas fixados a uma lmina histolgica pelo calor, com o corante cristal violeta que cora as clulas com cor prpura. Este corante se impregna em todas as clulas e esta primeira colorao denominada colorao primria. </p> <p>Logo aps, as clulas so recobertas por uma soluo de iodo que age como um mordente que qualquer substncia que forma um complexo insolvel quando se liga ao corante primrio.</p> <p>A seguir, as lminas contendo o esfregao de clulas so lavadas com etanol 95% (agente descolorante), que descora seletivamente alguns tipos de clulas. O lcool ento removido por lavagem em gua e as clulas so coradas por um segundo corante, a safranina, um contracorante, sendo sua colorao bem diferente daquela dada pelo cristal violeta. As bactrias denominadas Gram + adquirem cor prpura (roxo), enquanto as Gram apresentam colorao cor-de-rosa.</p> <p>O princpio da tcnica est baseado na diferena de composio da parede de diferentes bactrias e na capacidade destas paredes em reterem os corantes utilizados. Sabemos hoje que as bactrias Gram + possuem uma parede celular mais espessa e diferente da parede das bactrias Gram...</p>