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    23-Dec-2015

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  • ACTUALIZACIN SOBRE EL DESARROLLO DE MEDIOS DE CULTIVO CROMOGNICOS Y

    FLUOROGNICOS

    CUBADr.C.T.Claudio Rodrguez MartnezDirector de InvestigacionesCentro Nacional de Biopreparados

  • DISEO DE MEDIOS CULTIVO

    BIOQUMICA QUMICAMICROBIOLOGA QUMICA

    TECNOLOGA

  • NECESIDAD DE OPTIMIZAR LOS NECESIDAD DE OPTIMIZAR LOS MMTODOS DE AISLAMIENTO E TODOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIIDENTIFICACINN

    EMPLEO DE MEDIOS DE EMPLEO DE MEDIOS DE CULTIVO QUE CUMPLAN CULTIVO QUE CUMPLAN

    CON LAS NUEVAS CON LAS NUEVAS EXIGENCIAS DEL EXIGENCIAS DEL

    DIAGNDIAGNSTICO MODERNOSTICO MODERNO

  • MAYORMAYORRAPIDEZRAPIDEZ

    CUCULES SON LAS EXIGENCIAS MODERNAS PARA LES SON LAS EXIGENCIAS MODERNAS PARA EL DIAGNEL DIAGNSTICO MICROBIOLSTICO MICROBIOLGICO?GICO?

    ELEVADAELEVADAESPECIFICIDADESPECIFICIDAD

    ALTAALTASENSIBILIDADSENSIBILIDAD

  • AUMENTO DE LA ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DIAGNAUMENTO DE LA ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DIAGNSTICA STICA MEDIANTE MODIFICACIONES A LAS FORMULACIONES EXISTENTES MEDIANTE MODIFICACIONES A LAS FORMULACIONES EXISTENTES

    MINIATURIZACIMINIATURIZACINN

    EMPLEO DE NUEVOS AGENTES GELIFICANTES Y SOPORTES QUE EMPLEO DE NUEVOS AGENTES GELIFICANTES Y SOPORTES QUE SUSTITUYAN EL AGARSUSTITUYAN EL AGAR

    MEDIOS CON SUSTRATOS CROMOGMEDIOS CON SUSTRATOS CROMOGNICOS, FLUOROGNICOS, FLUOROGNICOS NICOS U OTROS OBTENIDOS POR SU OTROS OBTENIDOS POR SNTESISNTESISAUMENTO DE LA PRODUCCIAUMENTO DE LA PRODUCCIN DE MEDIOS LISTOS PARA EL USON DE MEDIOS LISTOS PARA EL USO

    NUEVOS CONTENEDORES PARA LOS MEDIOSNUEVOS CONTENEDORES PARA LOS MEDIOS

    NUEVOS MEDIOS PARA MICROORGANISMOS MANIPULADOS NUEVOS MEDIOS PARA MICROORGANISMOS MANIPULADOS GENGENTICAMENTE, O PARA MICROORGANISMOS ANTES NO ESTUDIADOS O TICAMENTE, O PARA MICROORGANISMOS ANTES NO ESTUDIADOS O CULTIVADOS CULTIVADOS

    NUEVOS MEDIOS PARA LA PRODUCCINUEVOS MEDIOS PARA LA PRODUCCIN DE METABOLITOS A NIVEL N DE METABOLITOS A NIVEL INDUSTRIALINDUSTRIAL

    AUTOMATIZACIAUTOMATIZACIN DE LA INOCULACIN DE LA INOCULACIN, LECTURA DE RESULTADOS, Y N, LECTURA DE RESULTADOS, Y CCLCULOS DE LOS MEDIOSLCULOS DE LOS MEDIOS

    TENDENCIAS ACTUALES EN EL DESARROLLO TENDENCIAS ACTUALES EN EL DESARROLLO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y SU EMPLEODE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y SU EMPLEO

    Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB

  • MEDIOS DE CULTIVOMEDIOS DE CULTIVO

    CROMOGCROMOGNICOS Y FLUOROGNICOS Y FLUOROGNICOSNICOS

  • MedioMedio

    Medio

    ETIOLOGETIOLOGAA

  • Pueden ser considerados, Pueden ser considerados, como tales, aquellos medios como tales, aquellos medios que incluyen, en su que incluyen, en su formulaciformulacin final, uno o mn final, uno o ms s sustratos cromogsustratos cromognicos y/o nicos y/o fluorogfluorognicosnicos

    DEFINICIDEFINICIN No. 1N No. 1

    Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB

  • DEFINICIDEFINICIN No. 2N No. 2Pueden considerarse aquellos medios de cultivo que estn destinados a identificar los microorganismos sobre la base de reacciones enzimticas tpicas, dando lugar a la rotura del enlace entre el sustrato de la reaccin enzimtica y un grupo cromforo o fluorforo unido a dicho sustrato y provocando con ello un cambio de color o emisin de luz.

  • AguaAguaSustratos cromogSustratos cromognicos y/o fluorognicos y/o fluorognicosnicosSustancias Sustancias opacantesopacantes o contrastanteso contrastantesIndicadoresIndicadoresBases nutritivasBases nutritivasFuentes de carbono (azFuentes de carbono (azcares, alcoholes, etc.)cares, alcoholes, etc.)AgarAgarSales mineralesSales mineralesInhibidores selectivos (sales, antibiInhibidores selectivos (sales, antibiticos, etc.)ticos, etc.)Otras sustancias (proteOtras sustancias (protenas, aminonas, aminocidos, etc.)cidos, etc.)

    COMPONENTESCOMPONENTES FUNDAMENTALESFUNDAMENTALES

    Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB

  • ENZIMAS CARACTERSTICAS

    SUSTRATOS CROMOGNICOS Y/O FLUOROGNICOS

    GRUPOS CROMFOROS Y/O FLUORFOROS

    INDICADORES SUSTRATOS COLONIAS

    degradan

    liberando

    provocan cambios en caractersticas cromticas de:

    PRINCIPIOSPRINCIPIOS

    Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB

  • 1.1. Cambio de la intensidad de la fluorescencia Cambio de la intensidad de la fluorescencia o de las caractero de las caractersticas cromsticas cromticas de las cticas de las clulas, lulas, por la absorcipor la absorcin de los compuestos derivados de n de los compuestos derivados de los sustratos por diferentes componentes los sustratos por diferentes componentes celulares.celulares.

    2.2. Aumento de la fluorescencia y de la Aumento de la fluorescencia y de la absorciabsorcin de luz de los sustratos.n de luz de los sustratos.

    3.3. Cambio de los atributos cromCambio de los atributos cromticos ticos (absorbancia y/o fluorescencia) de los (absorbancia y/o fluorescencia) de los indicadores.indicadores.

    PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCINN

    Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB

  • SUSTRATO SINTTICOENZIMAS BACTERIANAS HIDROLIZAN

    CAUSAN

    1. INCREMENTO EN LA FLUORESCENCIA DE LOS SUSTRATOS

    2. INCREMENTO DE LA ABSORCIN DE LUZ DE LOS SUSTRATOS

    PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCINN

    No. 1

    Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB

  • HIDROLIZAN

    CAUSA

    1. INCREMENTO EN LA FLUORESCENCIA DE UN INDICADOR

    2. INCREMENTO DE LA ABSORCIN DE LUZ DE UN INDICADOR

    PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCINN

    No. 2

    ENZIMAS BACTERIANAS

    SUSTRATO SINTTICO

    Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB

  • COLORANTE FLUORESCENTE

    DENTRO DE ALGUNO DE SUS COMPONENTES

    Clula bacteriana ABSORBE

    CAUSA

    INCREMENTO EN LA FLUORESCENCIA

    PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCINN

    No. 3

    EJ. COLORANTE

    S

    a) Naranja acridina (AO) se une al DNA

    b) cido sulfnico 8-anilinonaftaleno(ANS) se une a las protenas

    Microscopio de epifluorescencia

    Tcnica de filtro directo epifluorescente

    Citometra de flujo

    Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB

  • Clula de bacteria Gram +

    PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCINN

    sustrato

    Difusin pasiva

    Clula de bacteria Gram -

    sustrato

    permeasa u otros(ej. sales biliares)

    Difusin activa

    osmosis

    Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB

  • Clula de bacteria

    PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCINN

    Gradiente de iones

    Inactivo en la fase estacionariaAmplia especificidadBaja sensibilidadRequiere altas concentracionesSe inactiva con el estrs celular

    Sistema de transporte mediado por elfosfoenol piruvato (fosfo-transferasa)

    Activo en todas las fasesMenor especificidadMayor sensibilidadNo requiere de altas concentracionesMs sensible a las estructuras de aplicones

    DIFUSIN ACTIVA

    Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB

  • PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCINN

    CADENA DE REACCIONES

    Enzima

    +Permeasa + Inductor

    Ejemplo: -galactosidasa + lactosa (inhibicin competitiva) IPTG (acelerador)

    lac-operon

    + X-Gal + sales biliares

    Precipitado azul

    Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB

  • Permiten una deteccin visual de los productos de la actividad enzimtica, ya sea directamente, o con una fuente de luz ultravioleta o con un fluormetro.

    Pueden ser acoplados a un amplio rango de sustratos para diferentes rutas metablicas.

    Estos sustratos no son carcinognicos.

    CARACTERSTICAS DE LOS SUSTRATOS FLUOROGNICOS

  • indicadores fluorescentes con diferentes pH ptimos

    4-MU como indicador para la deteccin de un incremento en el pH

    quinina para la deteccin de una disminucin del pH

    Actividad de ureasa

    Formacin de cido de mono y disacridos

    Descarboxilacinde la lisina y ornitina

    PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCINN

    Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB

  • Naturaleza quNaturaleza qumica de los grupos crommica de los grupos cromforosforos

    SustratosSustratos Color de los Color de los precipitadosprecipitados

    AbsorbciAbsorbcinn, , max max ((nm)nm)

    X (5X (5--bromobromo--44--clorocloro--33--indolil)indolil) Azul turquesaAzul turquesa 615615

    Y ( Y ( indoxilindoxil)) AzulAzul 680680

    Magenta (5Magenta (5--bromobromo--66--clorocloro--33--indolil)indolil) MagentaMagenta 565565

    SalmonSalmon (6(6--clorocloro--33--indolil)indolil) SalmSalmnn 540540

    Iodo (5Iodo (5--iodoiodo--33--indoxilindoxil)) PPrpurarpura 575575

    GreenGreen (N(N--metilmetil--indolil)indolil) VerdeVerde 665665

    o o pp--nitrofenolesnitrofenoles AmarilloAmarillopp--nitroanilinanitroanilina AmarilloAmarillo 390390CHE CHE ((cicloesculetinacicloesculetina + iones)+ iones) NegroNegro

    Dr.C.T.Claudio Rodrguez Martnez. CNB

  • Naturaleza quNaturaleza qumica de los grupos crommica de los grupos cromforosforos

    SustratosSustratos Color de los Color de los precipitadosprecipitados

    Alizarina 3Alizarina 3,4,4--dihidroxiflavonadihidroxiflavona--44-- (DH)(DH) NegroNegro

    RojoRojo BrillanteBrillante 3B3B--AA + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter RojoRojo

    CibacronCibacron AzulAzul 3GA3GA + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter AzulAzul

    Reactive Orange 14Reactive Orange 14 + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter NaranjaNaranja

    77--NN--((--alanil)aminoala