Cuaderno Prac Taller IV

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    24-Apr-2015

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<p>i</p> <p>UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CHIAPAS CENTRO DE BIOCIENCIAS LICENCIATURA DE INGENIERO BIOTECNLOGO UNIDADES DE HABILITACIN DE TALLER EXPERIMENTAL IV PROFESOR RESPONSABLE: M. en B. Sonia Ruiz Gonzlez</p> <p>ii</p> <p>CONTENIDOUnidad de Habilitacin Ttulo Pgina</p> <p>1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14</p> <p>Contexto: Licenciatura de Ingeniero Biotecnlogo Introduccin al Taller Experimental IV Normas bsicas para trabajar en el laboratorio Normas de seguridad al manejar sustancias Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo y materiales usados en microbiologa Aislamiento de bacterias y hongos de muestras de suelo Cuantificacin, purificacin y conservacin de bacterias y hongos Morfologa macroscpica y microscpica de bacterias y hongos Pruebas de diferenciacin bioqumica en microorganismos Observacin de la ruta anablica fotosinttica Cuantificacin de la concentracin de CO2 consumido en la fotosntesis Aislamiento de DNA de bacterias del gnero Azospirillum Electroforesis de DNA de Azospirillum en gel de agarosa Amplificacin de DNA mediante reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Estimacin de la biodiversidad: simulacin de comunidades para calcular ndices de diversidad Estimacin de la riqueza y abundancia de especies vegetales en un agroecosistema Diseo completamente aleatorizado: Evaluacin de dos fuentes de carbono en el crecimiento de Escherichia coli Diseo factorial: Evaluacin de fuentes de carbono y pH, a distintos niveles, en el crecimiento de Escherichia coli</p> <p>iv v vi viii 01 05 09 13 18 22 25 28 32 36 41 48 51 56</p> <p>iii</p> <p>Contexto: Licenciatura de Ingeniero Biotecnlogo La Universidad Autnoma de Chiapas cre, en 1993, la Licenciatura de Ingeniero Biotecnlogo, cuyo plan de estudios ha ido evolucionando. La modificacin de dicho plan, en 2002, instal, entre otras innovaciones, la figura de los Talleres Experimentales. La formacin de recursos humanos de alto nivel en reas cientfico tecnolgico, como la biotecnologa, requiere de un espacio para el desarrollo de habilidades prcticas; entendidas estas no como la realizacin de actividades mecnicas basadas en instructivos establecidos, inflexibles y monodisciplinarios, sino como un espacio en el que se promueva la capacidad del alumno de integrar el conocimiento adquirido en las aulas. El Taller Experimental plantea lo anteriormente mencionado buscando que el alumno pueda utilizar el conocimiento en la resolucin de problemas puntuales con pensamiento holstico y aplicando lo aprendido en varias disciplinas. El Taller Experimental plantea al alumno integrar todos los conocimientos adquiridos en el semestre a travs de la elaboracin de un proyecto. Por lo tanto, es el espacio donde, a travs de la experimentacin, el alumno integra el conocimiento que est adquiriendo en el ciclo escolar que le toca cursar. Adems, es una base para generar el trabajo en grupo, tan necesario en nuestra sociedad.</p> <p>iv</p> <p>Introduccin al Taller Experimental IV El Taller Experimental IV plantea al alumno llevar a cabo un proyecto en el que ocupe elementos de Microbiologa, Procesos Bioqumicos Celulares, Diseo Experimental, Biodiversidad y Biologa Molecular. Previamente, el estudiante recibe una serie de Unidades de Habilitacin que le proveen herramientas para la realizacin del proyecto.</p> <p>OBJETIVO GENERAL. El alumno integrar el conocimiento adquirido / construido en las asignaturas bsicas del cuarto semestre.</p> <p>PROGRAMA. La asignatura se desarrolla va la realizacin de proyectos integrales por parte de los alumnos. El trabajo se realizar en equipos, guiados por el docente. El contenido de los proyectos ser definido previo a la apertura del curso por los Cuerpos Acadmicos del Centro de Biociencias y otros expertos en las materias; esto permitir que la naturaleza del Taller Experimental IV sea, desde cualquier ngulo, flexible en su contenido, el cual necesariamente deber cambiar curso a curso.</p> <p>v</p> <p>NORMAS BSICAS PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO 1.- Toda persona que requiera trabajar en el laboratorio deber UTILIZAR BATA y, en su caso, GUANTES Y CUBREBOCAS. 2.-Durante la estancia en el laboratorio, la persona deber ABSTENERSE DE INGRESAR E INGERIR ALIMENTOS Y BEBIDAS. 3.-La persona que trabaje en el laboratorio deber AUXILIARSE del PROFESOR y/o LABORATORISTA, para el MANEJO DE EQUIPO. 4.- La persona que trabaje en el laboratorio TIENE la OBLIGACIN de anotarse en la BITCORA DE USO DEL EQUIPO, la fecha, hora y el para qu lo emplearon. 5.-La persona que trabaje en el laboratorio deber MANTENER LIMPIA EL AREA ASIGNADA. 6.-La persona que trabaje en el laboratorio DEBER observar las normas bsicas de seguridad al MANEJAR las SUSTANCIAS QUMICAS. 7.-La persona que trabaje en el laboratorio TIENE la OBLIGACIN de REPORTAR los DESPERFECTOS DE MATERIALES Y EQUIPOS. 8.-Por la naturaleza del trabajo de laboratorio, la persona que trabaje en dicha instalacin deber ABSTENERSE de JUGAR O BROMEAR. 9.-Por ser DISTRACTORES, el uso de la COMPUTADORA y de TELFONO CELULAR dentro del laboratorio, est RESTRINGIDO, a menos que el PROFESOR lo permita. 10.-Las personas que trabajen en el laboratorio DEBERN RESPETAR el horario ASIGNADO.</p> <p>vi</p> <p>11.-La SOLICITUD de material, equipo y reactivos deber realizarse en el formato correspondiente y es RESPONSABILIDAD del solicitante su buen uso. 12.-Es RESPONSABILIDAD de cada persona tener a la mano los implementos individuales que el PROFESOR le solicite para el ptimo desarrollo de su labor y RESPETAR las PERTENENCIAS DE SUS COMPAEROS Y PROFESORES. 13.-Cuando una persona o grupo de personas NECESITE trabajar en el laboratorio en horario DIFERENTE al asignado, el PROFESOR correspondiente deber de ponerse de acuerdo con el LABORATORISTA. En este caso el PROFESOR es el responsable del comportamiento del alumno. LAS REGLAS AQU MENCIONADAS SON DE OBSERVANCIA GENERAL, LO QUE PERMITE EL PTIMO EMPLEO DE LA INFRAESTRUCTURA, DE LOS MATERIALES Y DEL EQUIPO DEL CenBio, PERO SOBRE TODO POR EL BIENESTAR DE LOS USUARIOS.</p> <p>vii</p> <p>Normas de seguridad al manejar sustanciasEn las distintas Unidades de Habilitacin que integran el presente Cuadernillo se utilizan sustancias qumicas potencialmente peligrosas para los usuarios o el ambiente. A continuacin se presenta uno de los cdigos de riesgos ms communes; es de suma importancia seguir las recomendaciones para cada caso.</p> <p>Sustancias explosivas. Peligro. Este smbolo seala sustancias que pueden explotar bajo determinadas condiciones. Ejemplo: dicromato de amonio. Precaucin. Evitar choques, percusin, friccin, formacin de chispas y contacto con el calor. Sustancias oxidantes (comburentes). Peligro. Los compuestos comburentes pueden inflamar sustancias combustibles o favorecer la amplitud de incendios ya declarados, dificultando su extincin. Ejemplo: permanganato de potasio, perxido de sodio. Precaucin. Evitar cualquier contacto con sustancias combustibles.</p> <p>viii</p> <p>Sustancias fcilmente inflamables. a. b. Sustancias autoinflamables. Ejemplo: alquilos de aluminio, fsforo. Precaucin. Evitar contacto con el aire. Gases fcilmente inflamables. Ejemplo: butano, propano. Precaucin. Evitar la formacin de mezclas inflamables gas-aire y aislar de fuentes de ignicin. Sustancias sensibles a la humedad. Productos qumicos que desarrollan emanaciones de gas inflamable al contacto con el agua. Ejemplo: litio, borohidruro de sodio. Precauciones: evitar contacto con agua o con humedad. Lquidos inflamables. Son aquellos lquidos que fcilmente pueden arder. El que un lquido arda con ms o menos facilidad depende de su punto de llama.</p> <p>c.</p> <p>d.</p> <p>Sustancias txicas. Peligro. Tras una inhalacin, ingestin o absorcin a travs de la piel pueden presentarse, en general, trastornos orgnicos de carcter grave o incluso la muerte. Ejemplo: trixido de arsnico, cloruro de mercurio(II). Precaucin. Evitar cualquier contacto con el cuerpo y en caso de malestar acudir inmediatamente al mdico. Sustancias nocivas. Peligro. La incorporacin de estas sustancias por el organismo produce efectos nocivos de poca trascendencia. Ejemplo: tricloroetileno. Precaucin. Evitar el contacto con el cuerpo humano as como la inhalacin de vapores. En caso de malestar acudir al mdico. Sustancias corrosivas. Peligro. Por contacto con estas sustancias se destruye el tejido vivo y tambin otros materiales. Ejemplo: bromo, cido sulfrico. Precaucin. No inhalar los vapores y evitar el contacto con la piel, los ojos y la ropa. Sustancias irritantes. Peligro. Este smbolo destaca en aquellas sustancias que pueden producir accin irritante sobre la piel, los ojos y sobre los rganos respiratorios. Ejemplo: amonaco, cloruro de bencilo. Precaucin. No inhalar los vapores y evitar el contacto con la piel y los ojos. Sustancias peligrosas para el ambiente. En general, todas las sustancias que naturalmente no estn en un ambiente dado son potencialmente dainas para la flora, la fauna o los microorganismos. De las sustancias usadas en el Taller Experimental IV, el bromuro de etidio es un ejemplo de este tipo de sustancias.</p> <p>ix</p> <p>Unidad de Habilitacin No. 1 Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo y materiales usados en microbiologa</p> <p>Introduccin. La base del estudio de los microorganismos es el medio de cultivo, sobre el cual se hacen crecer de forma individual permitiendo su caracterizacin. El medio de cultivo debe estar completamente libre de otros microorganismos del ambiente, de manera que no haya interferencias con los microorganismos de inters. Se llama esterilizacin a los procedimientos que dejan al objeto o material tratado libre de toda forma de vida. La esterilizacin puede llevarse a cabo con distintos tipos de agentes: fsicos y qumicos. Por otro lado, en microbiologa, todas las manipulaciones deben ser llevadas a cabo de modo que se impida cualquier tipo de contaminacin en el rea de trabajo. Los procedimientos utilizados para conseguirlo se conocen con el nombre de tcnica asptica, y se citan a continuacin: - Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar o el material de vidrio (en zonas estriles) antes de tomar la muestra de microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor. - Despus de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar. Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez destapadas, y despus de la inoculacin. - Durante la inoculacin, los tapones se mantienen en la mano sujetndolos por la parte que no entra en contacto con tubos y matraces. - Los tubos abiertos deben mantenerse en posicin inclinada para que el riesgo de contaminacin sea mnimo. - Las tapas de las placas Petri no deben colocarse sobre la mesa de trabajo.</p> <p>1</p> <p>Objetivo. Preparar y esterilizar medios de cultivo y materiales utilizados en microbiologa por medio de calor hmedo.</p> <p>Material y mtodos. 2 matraces Erlenmeyer de 500 mL 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL 1 esptula 1 probeta de 250 mL 1 piceta 1 vaso de precipitados de 400 mL 2 placas de Petri de vidrio 20 placas de Petri desechables 15 puntas para micropipeta de 1000 L (azules) 20 puntas para micropipeta de 200 L (amarillas) 10 tubos de ensayos de 16 x 150 mm Palitas triglsicas 1 frasco de vidrio con tapa de rosca 2 mecheros Fisher 1 potencimetro 1 autoclave 1 parrilla agitadora con magneto Papel aluminio Soluciones buffer pH 7.0 y pH 4.0 agar dextrosa papa agar nutritivo agar bacterilogico</p> <p>Procedimiento: Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo. 1.- Prepare 250 mL de medio de cultivo de agar dextrosa papa (ADP) y agar nutritivo (AN), siguiendo las instrucciones del fabricante (lea la etiqueta del frasco).</p> <p>2</p> <p>2.- Para tener una consistencia de los medios ms firme, agregue 5 g de agar bacteriolgico por cada litro de medio y ajuste el pH. Para bacterias (AN) a un pH 7.0 y para hongos (ADP) a pH de 5.6. 3.- Coloque los medios en matraces Erlenmeyer, agite bien, colqueles tapones de algodn y gasa, y esterilcelos mediante calor hmedo (autoclave). La esterilizacin en autoclave implica el calentamiento de los materiales a 121 C (1 atmsfera de presin) durante al menos 20 minutos. 4.-Mientras se esterilizan los materiales practique el vaciado en placa, utilizando agua con placas de Petri de vidrio. 5.-Despus de esterilizar, enfre los matraces con medios de cultivo a 45 C para vaciarlos en las placas de Petri desechables; cada placa de 10 cm de dimetro deben recibir aproximadamente 20 mL de medio. Este procedimiento deber realizarse en un rea desinfectada, por ejemplo en una campana de flujo laminar; tambin puede utilizar una mesa limpia y libre de corrientes de aire, usando dos mecheros Fisher para mantener la esterilidad del rea. 6.- Espere a que el medio se gelifique, selle las placas con cinta de plstico autoadherible (KleenPack) y djelas en un sitio seco y limpio durante 24 horas a temperatura ambiente para verificar la esterilidad. Despus de este tiempo no deber haber contaminacin por bacterias u hongos en los medios. En caso de esterilidad, estarn listos para usarse en el aislamiento de microorganismos. Preparacin de materiales para aislamiento de microorganismos. 1.- A cada uno de 10 tubos de ensayos de 16 x 150 mm agregue 9 mL de agua destilada o solucin salina, colqueles tapones de algodn/gasa y esterilcelos en autoclave. 2.- Esterilice en autoclave un matraz Erlenmeyer de 250mL que tenga una marca en el volumen de 100 mL; para esto agregue 100 mL de agua con una probeta y marque el nivel alcanzado por el agua con una cinta adhesiva (masking tape). 3.- Coloque un agitador magntico en el interior del matraz, colquele un tapn de algodn/gasa y esterilcelo en autoclave.</p> <p>3</p> <p>4.- Esterilice en autoclave los siguientes materiales: puntas de micropipeta amarillas y azules (colocadas en un frasco con tapa de rosca o en un portapuntillas); cuadros de papel aluminio de 5x5 cm; pipetas de vidrio de 10 mL y esptula (envueltos en papel estraza); 100 mL de agua destilada. 5.- Todo el material ser utilizado en la prctica de aislamiento de bacterias y hongos.</p> <p>Cuestionario que deber responder y anexar al reporte: 1.- Cules son los mtodos de esterilizacin fsica que ms se utilizan? Explique en que consiste cada uno de ellos. 2.- Cules son los mtodos de esterilizacin qumica ms utilizados? Explquelos.</p> <p>BIBLIOGRAFIA:Campbell, R., (1987). ECOLOGA MICROBIANA, edit. Limusa., pp. 1123. Mxico, D.F. Madigan, M. T., Martnho, J. M., Parker, Jack. . Brock Microbiologa de los microorganismos. 10. Edicin. Person Prentice Hall. Espaa. Aquiahuatl, M. A. y Prez M. L. (2004) Manual de Prcticas de Laboratorio de Microbiologa General. Depto. De Biotecnologa. Universidad Autnoma Metropolitana.</p> <p>Schlegel, Hans G. (1997). Microbiologa General . 9. Edicin. Barcelona , Espaa. Pp. 654.</p> <p>4</p> <p>Unidad de Habilitacin No. 2 Aislamiento de bacterias y hongos de muestras de suelo Introduccin. En microbiologa se trabaja con cultivos puros de microorganismos. Un cultivo puro es aqul en que todas las clulas provienen de una sola clula inicial. Una colonia de cualquier microorganismo es un cultivo puro, ya que todas sus clulas proceden de una inicial; por lo tanto, cuan...</p>