Expose de Biochimie Clinique_ Dosage Du Glucose, Uree, Mycoglobine, Creatinine

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    02-Jan-2016

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Travail Personnel de lEtudiant Kagning Tsinda Emmanuel

UE: BIOCHIMIE CLINIQUE

TRAVAIL PERSONNEL DE LETUDIANT

THEMES A DEVELOPER:

Principe et mthode de llectrophorsePrincipe de mthode de dosage du glucoseTechnique et principe de dosage de la cratinine,Technique et principe de dosage de lureTechnique et principe de dosage lacide uriqueLes mthodes immunomtriques dans le dosage de la myoglobineRdig par:KAGNING TSINDA EmmanuelMatricule: 08N042FSNiveau: Etudiant en Master 1Option: Bactriologie et virologie mdicaleEnseignantDr Jules Clment Nguedia AssobAnne acadmique : 2011-2012

SOMMAIRESOMMAIRE1INTRODUCTION GENERALE3THEME 1: LE PRINCIPE ET LA PROCEDURE DE REALISATION DE4I.INTERET DE LELECTROPHORESE4II.PRINCIPE GENERAL (1)4III.PROCEDURES DE REALISATION DE LELECTROPHORESE: mthode avec les Instruments MIDIGEL6IV.APPLICATIONS DE LELECTROPHORESE12VI.1 Application de lElectrophorse lidentification des phnotypes molculaires et des gnotypes; cas de la drpanocytose (3)12VI.2 Application de l'lectrophorse en immunologie: sparation des anticorps sriques14Thme 2: PRINCIPE ET PROCEDURE DE DOSAGE DU GLUCOSE18I.Intrt clinique de la mesure de la Glycmie18II.Mthode de Dosage :18II.1 Principe se basant sur la mthode enzymatique de Trinder18II.2 Procdure19THEME 3: PRINCIPE ET DOSAGE DE L'UREE PAR LA METHODE CINETIQUE22I.Intrt du dosage22II.Principedu dosage enzymatique22III.Mthode de dosage22THEME 4: PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE DE LA CREATININE25I.INTERET CLINIQUE (10)25II.PRINCIPE ET METHODE DU DOSAGE : mthode photomtrique colorimtrique selon la raction de JAFFE.25II.1 Principe25II.2 Mthode de dosage (8)25THEME 5: PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE DE LACIDE URIQUE (10)30I.INTERET DU DOSAGE30II.PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE30II.1 Principe30II.b Mthode Uricase de dosage30THEME 6: TECHNIQUES IMMUNOMETRIQUES DU DOSAGE DE LA MYOGLOBINE34I.Gnralits et Intrt clinique du dosage de la myoglobine (11)34II.Mthodes du dosage341.Immunoprcipitation352.Immuno-turbidimetrie et immuno-nphlomtrie35a.Immuno-turbidimetrie35b.immuno-nphlomtrie: Cas particulier de la nphlmtrie (2)36c.Mthode du dosage via lImmuno-turbidimetrie et immuno-nphlomtrie37CONCLUSION GENERALE38BIBLIOGRAPHIE39

Travail Personnel de lEtudiant Kagning Tsinda Emmanuel

Principe et mthode de dosage de la Cratinine Page 1/39

INTRODUCTION GENERALE

La Biochimie clinique est lapplication des aspects chimiques de la vie de lhomme sain ou malade et lapplication des mthodes chimiques employes au laboratoire pour le diagnostic, le control dun traitement, et la prvention des maladies. Pour ce faire, la connaissance des principes et procdures de diagnostic des diffrents composs marqueurs de pathologies est indispensable. Le cours sur la grande majorit de mthodes de dosages biochimiques nous a t dispens par le Dr Jules Clment Assob Nguedia. Cependant, il nous est demande, dans le cadre dun travail Personnel de ltudiant, de prsenter le principe et mthode de ralisation de llectrophorse, le principe de mthode de dosage du glucose, la technique et principe de dosage de la cratinine, de lure, de lacide urique, et enfin, le principe et mthode immunomtriques dans le dosage de la myoglobine.Introduction GnralePage 3/39

THEME 1: LE PRINCIPE ET LA PROCEDURE DE REALISATION DE LELECROPHORESEI. INTERET DE LELECTROPHORESE De nos jours, llectrophorse est devenue une technique de routine dans les laboratoires o on lutilise pour sparer notamment les protines et les acides nucliques. Llectrophorse des protines peut tre ralise sur des supports varis, notamment sur gel de polyacrylamide ou sur gel dagarose selon les informations recherches. Llectrophorse de protines sur gel dagarose est la technique la plus aise et la moins coteuse mettre en uvre dans un tablissement denseignement avec un matriel limit. Elle ncessite simplement une cuve lectrophorse et une alimentation continue. (1)Durant notre prsentation, tout en prcisant que llectrophorse peut aussi semployer pour sparer les acides nucliques, nous tacherons de parler du principe gnral de llectrophorse ensuite, nous prsenterons ses applications selon quon se trouve en hmatologie et en immunologie. II. PRINCIPE GENERAL (1)L'lectrophorse est une technique biochimique de sparation fonde sur le fait que des molcules portant des charges lectriques diffrentes migrent des vitesses diffrentes lorsqu'elles sont places dans un champ lectrique.Llectrophorse sur support ou lectrophorse de zones permet de stabiliser la phase liquide grce lutilisation dun support poreux imprgn d'un solvant tamponn. Principes de la migration lectrophortique: la migration dpend de plusieurs facteurs : de la mobilit lectrophortique U, qui est fonction de la charge et de la gomtrie de la particule. Une particule de charge lectrique Q, place dans un champ lectrique E, est soumise une force F qui l'entrane vers l'lectrode de signe oppos :

Des forces de frottement f, dues la viscosit du milieu , s'opposent la migration de la particule, et ce d'autant plus que la particule est grosse (r = rayon) et que la vitesse de migration (v) est grande :

(N.B. Le coefficient de viscosit dpend de la temprature)

Il arrive un moment o ces deux forces s'quilibrent, et la particule se dplace alors vitesse constante; on peut alors crire:

On dfinit pour chaque particule sa mobilit , de manire indpendante du champ lectrique, par la relation :

La mobilit est une caractristique de chaque particule; il est donc possible d'effectuer une sparation en se basant sur cette proprit. La charge Q est fonction du pH isolectrique de la particule et du pH du solvant : on appelle pH isolectrique d'une particule (pHi ou pI) le pH pour lequel cette particule ne migre pas dans un champ lectrique (ceci est une dfinition exprimentale). Pour les molcules de petite taille, on peut prvoir la valeur du pHi en calculant le pH isoionique, pH pour lequel la charge nette est nulle, partir des pKa des diffrents groupements ionisables de la molcule; mais cela n'est pas possible pour les macromolcules, car leur environnement ionique modifie notablement leur charge relle. La diffrence pH - pHi dtermine le signe de la charge Q d'une particule. (1) A chaque acide amin correspond une valeur de pH isolectrique, (pHi auquel les acides amins sont lectriquement neutres). En dehors de ce " point isolectrique " les acides amins sont globalement chargs et migrent sous l'effet d'un champ lectrique. Ainsi, en travaillant un pH fix (dans une solution tampon), on peut sparer diffrents acides amins par lectrophorse. Lorsque des acides amins sont placs dans un champ lectrique, ils migrent vers l'lectrode de polarit oppose, les molcules neutres ne migrant pas. Ainsi : quand pH>pHi, l'acide amin a une charge globale ngative : il migre vers l'lectrode positive(anode). Quand pH 20 000 UI/LPeroxydase (POD) > 1000 UI/L4-Amino-antipyrine (PAP) 0,8 mmol/LSubstance chromogne: Chloro-4-phnol 2 mmol/L (S2) Solution Etalon: Glucose 1 g/L (5,55 mmol/L) Prlvement et prparation du spcimen (8) Srum ou plasma :Sparer rapidement des cellules sanguines pour prvenir la glycolyse. Si le fluorure est utilis comme conservateur, une diminution de 0,09 g/L (0,5 mmol/L) est observe dans les deux premires heures, la concentration se stabilise ensuite.Le glucose est stable dans le srum et le plasma hparin : 8 h 25C.72 h 2-8C.Le glucose est stable dans le plasma (fluorure de sodium ou iodoactate) :24 h temprature ambiante. LCR : Analys immdiatement aprs collecte pour viter des rsultats sous valus. Conserver -20C. Urines : collectes en flacon opaque et conserves 2-8C. Conserver les urines de 24 h avec 5 ml dacide actique glacial ou 5 g de sodium benzoate ou fluorure. Limite de linarit: La raction est linaire jusqu 5 g/L (28 mmol/L). Au-del, diluer le spcimen avec une solution NaCl 9 g/L et refaire le dosage en tenant compte de la dilution dans le calcul du rsultat. La limite de linarit dpend du rapport de volume spcimen/ractif. Mode opratoire (technique manuelle)Matriel: Equipement de base du laboratoire danalyses mdicales, 2. Srums de contrle normaux et pathologiques.Le ractif de travail est constitu en mlangeant les solutions S1 et S2.Ramener les ractifs et spcimens temprature ambiante.

CALCUL de la concentration Le rsultat est dtermin daprs la formule suivante : Abs (dosage)Rsultat = x Concentration de lEtalon Abs (Etalon)

Cette mthode de Trinder peut aussi tre ralise l'aide de bandelettes ractives (ressemblant celles utilises pour les urines) dont l'extrmit, imprgne de ractifs, reoit une goutte de sang. La variation de coloration est apprcie soit visiblement l'aide d'une chelle colore soit par un lecteur portable indpendant et elle permet d'estimer la valeur de la glycmie. Le prlvement au bout du doigt permet donc de raliser facilement cet autocontrle glycmique si important maintenant pour l'quilibrage de la glycmie des diabtiques, en particulier ceux porteurs d'une pompe insuline, implante ou non.

Principe et mthode de dosage du Glucose Page 21/39

THEME 3: PRINCIPE ET DOSAGE DE L'UREE PAR LA METHODE CINETIQUE A L'UREASE (9)

I. Intrt du dosage Lure, CO (NH2)2 provient du catabolisme des protines et des acides amins par transamination ou par dsamination. Elle est forme dans le foie partir de l'ammoniac. Elle passe dans la circulation sanguine. Elle est limine essentiellement par le rein. Le taux d'ure dpend la fois de la fonction rnale, de la production hpatique, des apports azots alimentaires, du catabolisme protidique et de l'tat d'hydratation.II. Principedu dosage enzymatique La dtermination enzymatique de l'ure par mthode cintique se fait selon les ractions suivantes:Ure + H2O>en presence d urease > 2NH3 + CO22NH4+ + 2 alphoctoglutarate +2 NADH> en presence de GLDH > 2 Glutamate + 2NAD + 2H2OGLDH= 2-L-Glutamate dshydrognaseCette mthode est plus sensible et plus spcifique que la mthode la diactyl-monoxime.III. Mthode de dosage a) EchantillonsL'ure sanguine est ralise chez un sujet jeun depuis 10 heures environ. Le dosage de l'ure se fait sur le srum, le plasma et les urines de 24 heures qui peuvent tre congels moins 20C pendant 3 mois. Il est conseill d'viter de traiter les chantillons hmolyses, contamins ou ayant subi plus d'une dconglation. Le plasma est recueilli sur hparinate de lithium. Il faut viter les anticoagulants contenant les ions ammoniums et les fluorures. Il faut sparer le plus rapidement possible le srum ou le plasma du culot globulaire (dans les 2 heures qui suivent le prlvement). Les urines de 24 heures sont conserves +4C pour viter la pullulation microbienne, il faut les diluer au 1/100 dans de l'eau distille avant le dosage.b) RactifsCe sont des coffrets commercialiss dont il faut suivre le protocole fix par le fabricant. Ils contiennent en gnral les ractifs suivants:Ractif 1 : ADP 0,66 mmol/1GLDH >1 OOOU/lUrase > 30 OOOU/lNADH 0,32 mmol/1Alphactoglutarate 9 mmol/1 Ractif 2: Tampon tris pH 8 75 mmol/1 Etalon : n = 0/5g/l = (8,325 mmol/1)Dissoudre le ractif 1 dans le ractif 2 pour obtenir la solution de travail, elle reste stable pendant 5 jours 20 - 25C et 3 semaines +4C.c) Mode opratoireII faut s'assurer avant emploi que les ractifs et les chantillons sont la temprature ambiante pendant 10 20 minutes. Longueur d'onde : 340 nm Temprature d'incubation: 37c Le Zro de l'appareil se rgle avec de leau distille. Domaine de linarit : jusqu' 2g/l Stabilit de la coloration ; 30 minutes 20C-25C ou 10 minutes 37CLa mthode est linaire jusqu' 2g/l. Si la concentration en ure est suprieure cette valeur, il faut recommencer le dosage sur l'chantillon dilu au 1/2 avec une solution de NaCI 9g/l; en n'oubliant pas de tenir compte de cette dilution avant de rendre le rsultat qui sera multipli par 2.Mlanger et lire les densits optiques (D01) 30 secondes aprs l'addition de l'chantillon ou de l'talon, lire ensuite une seconde fois les densits optiques (D02) exactement 60 secondes aprs la premire lecture.Calcul : Ure (g/1) = (D02 - D01) chantillon x n/ (D02 - D01) talonn =Concentration de l'talon ure en g/1.Tenir compte de la dilution dans le cas des urines (rsultat x 100)Valeurs normales Srum - plasma : 0,15 0,45g/l Urines de 24 heures 12 30 g/24HLes valeurs normales varient en fonction de l'ge, du rgime protidique et de l'tat d'hydratation du sujet.d) Variations physiopathologiques Srum ou plasmaAugmentation: Rgime riche en protines/ Age>60 ans / Fivre/ Dshydratation/ Insuffisance rnale aigu/ Insuffisance rnale chroniqueDiminution: Age 90 g/l : probabilit dIDM- si >130 g/l : prdit lIDM avec une bonne sensibilit

Mthodes immunometriques du dosage de la myoglobine Page 37 sur 39

CONCLUSION GENERALE

Somme toute, il nous revenait de prsenter le principe et mthode de ralisation de llectrophorse, le principe de mthode de dosage du glucose, la technique et principe de dosage de la cratinine, de lure, de lacide urique, et enfin, le principe et mthode immunomtriques dans le dosage de la myoglobine. Nous avons successivement prsent lintrt clinique, le principe, le mode opratoire, les chantillons, les ractifs, les valeurs de rfrence de ces techniques biochimiques. Il savre que ces techniques sont toutes ncessaires pour un bon diagnostic et suivi des populations atteintes des diverses pathologies. Il est donc important que nous les connaissions et les appliquions (en plus ce celles prsentes par lenseignant, Dr Assob) durant nos pratiques hospitalires, afin dtre mieux outille en ce qui concerne la Biochimie Clinique.

Conclusion Gnrale Page 38

BIBLIOGRAPHIE

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