FISH FISH Hibridização in situ por Fluorescência Cristina Grumann

  • Published on
    17-Apr-2015

  • View
    103

  • Download
    1

Embed Size (px)

Transcript

<ul><li> Slide 1 </li> <li> FISH FISH Hibridizao in situ por Fluorescncia Cristina Grumann </li> <li> Slide 2 </li> <li> FISH O que ? a tcnica de citogentica molecular mais comumente utilizada. Utiliza sondas de DNA marcadas com fluorescncia para detectar anomalias cromossmicas que esto alm do poder de resoluo da citogentica de rotina, como microdelees e rearranjos cromossmicos complexos. </li> <li> Slide 3 </li> <li> FISH O que faz? Detecta seqncias especficas de cidos nuclicos pela formao de um duplex de um fragmento de cido nuclico de fita simples modificado (sonda) e sua seqncia complementar (seqncia alvo) no espcime fixado. A sonda de DNA reconhece e se hibridiza com sua seqncia complementar no cromossomo. </li> <li> Slide 4 </li> <li> FISH - Vantagens Pode ser aplicada tanto para clulas em pr- metfase, metfase como em interfase, o que permite fazer diagnsticos citogenticos mais acurados, tanto para anormalidades constitucionais, quanto para mudanas cromossmicas adquiridas como no caso de clulas cancerosas. tambm um instrumento valioso para mapeamento gnico. </li> <li> Slide 5 </li> <li> Pesquisas de aneuploidias podem ser feitas mais rapidamente. No h necessidade de crescimento em culturas das clulas. Tecidos preservados podem ser investigados. Pode ser aplicado para lminas padres de citogentica, mas tambm para tecidos fixados em formol, amostras de sangue e de medula ssea. FISH - Vantagens </li> <li> Slide 6 </li> <li> Quanto s bandas: Identificao de alteraes alm da resoluo visual (microdelees). Visualizao de rearranjos cromossmicos em regies camufladas pelas bandas (rearranjo crtico). Rearranjos de difcil interpretao como rearranjos dentro do cromossomo. FISH - Vantagens </li> <li> Slide 7 </li> <li> Preparao das sondas: - Mtodo direto: ligao com fluorocromo; - Mtodo indireto: molculas sinalizadoras - biotina, digoxigenina - conjugam-se com outra molcula ligada ao fluorocromo (avidina ou anticorpos). FISH - Etapas </li> <li> Slide 8 </li> <li> Preparao dos cromossomos. Preparao das lminas. Desnaturao da sonda e do DNA cormossmico aquecimento em soluo de formamida (70 C). </li> <li> Slide 9 </li> <li> As sondas ento colocadas sobre as lminas que so incubadas a 37 C overnight em cmara mida e escura. Durante esse perodo, a sonda se liga regio alvo do cromossomo e ocorre a hibridizao. FISH - Etapas </li> <li> Slide 10 </li> <li> Slide 11 </li> <li> Slide 12 </li> <li> No dia seguinte, a lmina lavada para a remoo das sondas em excesso. Contracolorao (counterstainig) Adio de solues que iro colorir o resto do material cromossmico. Mais usadas: DAPI (azul), propidium iodice (vermelho) FISH - Etapas </li> <li> Slide 13 </li> <li> Visualizao: em microscpio epifluorescente. filtros especficos para o os fluorocromos e couterstaining. FISH - Etapas </li> <li> Slide 14 </li> <li> FISH - Tipos de Sondas Sondas centromricas ou alfa satlites - para seqncias de DNA repetitivo localizadas no centrmero ou regio pericentromrica. Adequada para diagnstico de aneuploidias. </li> <li> Slide 15 </li> <li> Sonda Centromrica </li> <li> Slide 16 </li> <li> Slide 17 </li> <li> Em vermelho, cromossomo X e em verde, o Y </li> <li> Slide 18 </li> <li> Sonda Centromrica </li> <li> Slide 19 </li> <li> FISH - Tipos de Sondas Sondas de seqncia nica para o cromosssomo sondas especficas para deteminado loco ou gene. Delees e duplicaes submicroscpicas. </li> <li> Slide 20 </li> <li> Sondas de Seqncia nica </li> <li> Slide 21 </li> <li> FISH - Tipos de Sondas Sondas para cromossomo inteiro pintura cromossmica Rearranjos complexos; Identificao da origem de material cromossmico adicional (cromossomos em anel). </li> <li> Slide 22 </li> <li> Sonda Painting </li> <li> Slide 23 </li> <li> Em vermelho, o cromosomo 4 Sonda Painting </li> <li> Slide 24 </li> <li> FISH - Tipos de Sondas Cariotipagem por espectro multicolorido Deteco de pequenos rearranjos cromossmicos constitucionais ou adquiridos, como no cncer. </li> <li> Slide 25 </li> <li> Espectro Multicolorido </li> <li> Slide 26 </li> <li> Deteco de aneuploidias Aneuploidias dos cromossomos X e Y e trissomias do 21, 13 e 18 so responsveis por 90% das anomalias cromossmicas. Diagnstico em poucas horas. Anlise linfcitos do sangue perifrico e amostras de vilosidades corinicas, clulas do lquido amnitico ou cordo umbilical (em diagnstico pr-natal). Utilizao de sondas de seqncia nica ou alfa satlite. Contagem dos sinais fluorescentes na clula interfsica. FISH - Aplicaes </li> <li> Slide 27 </li> <li> Diagnstico pr-implantao Possvel com os avanos no campo da fertilizao in vitro. Remoo de 1 ou 2 blastmeros em embries de 3 dias. Permite diagnstico de alteraes cromossmicas ou gnicas. Seleo de sexo do embrio (em doenas ligadas ao X). FISH - Aplicaes </li> <li> Slide 28 </li> <li> Diagnstico pr-implantao Obs: Limitao da alta freqncia de mosaicismo na fase inicial do desenvolvimento humano com aneuploidias e poliploidias. FISH - Aplicaes </li> <li> Slide 29 </li> <li> Trissomia do 21 </li> <li> Slide 30 </li> <li> FISH - Aplicaes Sndromes de Microdelees Delees pequenas e de difcil deteco. Diagnstico mais preciso. Anlise dos cromossomos em metfase ou interfase. Usadas duas sondas: uma cromossomo- especfica e outra loco-especfica. </li> <li> Slide 31 </li> <li> Exemplos: Sndrome de Williams (7q-) - deleo de gene da elastina. Sndrome de Prader- Willi/Angelman(15q-). Sndrome do Miado do gato - cri-du-chat (5p-). Deficincia de esteride-sulfatase (Xp-). FISH - Aplicaes </li> <li> Slide 32 </li> <li> Sndrome de Williams Em verde o cromossomo 7 e, em vermelho, o gene da elastina </li> <li> Slide 33 </li> <li> Deficincia de Esteride- sulfatase Deficincia de esteride- sulfatase- Microeleo no cromossomo X </li> <li> Slide 34 </li> <li> Leucemias Avaliao da origem clonal. Caracterizao das alteraes cromossmicas e estruturais diagnstico, prognstico e tratamento. Deteco de doena residual mnima. Identificar recada da doena. Monitoramento ps-transplante: quando doador e receptor so de sexos diferente para verificao da proporo de clulas XX e XY. FISH - Aplicaes </li> <li> Slide 35 </li> <li> Leucemia Mielide Crnica (LMC) - Avaliao da presena do crossomomo Philadelphia - translocao entre 9 e 22- no visualizada em 5% das anlises da citogentica padro. FISH - Aplicaes </li> <li> Slide 36 </li> <li> Slide 37 </li> <li> Leucemia Linfide Crnica Trissomia do 12 em 30% dos casos. 14 q+ em 20%. Alteraes do 13 em 20%. Deleo 6q em 10%. FISH - Aplicaes </li> <li> Slide 38 </li> <li> Leucemia Mielide Aguda Leucemia promieloctica aguda: rearranjo PML/RAR - t(15;17). Leucemia mielomonoctica aguda: pesquisa da inverso do cromossomo 16 Leucemia monoctica aguda: pesquisa de alteraes envolvendo o gene MLL. Leucemias com monossomia 7, 5 ou trissomia 8 para deteco de doena residual no controle ps terapia. Leucemia mielide aguda com Ph ou BCR/ABL. FISH - Aplicaes </li> <li> Slide 39 </li> <li> Leucemia Linfide Aguda Cromossomo Ph. Rearranjo do gene MLL. Hiperdiploidia. Rearranjo dos genes TEL/AML1 FISH - Aplicaes </li> <li> Slide 40 </li> <li> Cncer de Mama FISH utilizado para demonstrar a amplificao de genes. A superexpresso de oncogenes tem papel importante na progresso de vrios tumores. 25-30% dos tumores de mama e ovrio tem amplificao do gene HER2/neu. FISH - Aplicaes </li> <li> Slide 41 </li> <li> HER2/neu um proto-oncogene localizado no cromossoma 17 e que codifica uma oncoprotena transmembrana, a p185 HER2. A presena do HER2/neu determina rpida proliferao do tumor e muita agressividade. Atravs de sondas de DNA complementares marcadas com fluorocromo, pode-se visualizar um nmero aumentado de cpias do gene em relao s 2 normalmente existentes. FISH - Aplicaes </li> <li> Slide 42 </li> <li> Cromossomo 17 em verde e os genes Her2 em laranja. </li> <li> Slide 43 </li> <li> Bibliografia ROONEY D.E., CzZEPULKOWSKI B.H.. Human Cytogenetics - Essencial Data. Reino Unidio. Ed. Wiley, 1997. Http://www.meds.com/molmime/ leukemia/guide/1660s13.jpg http://www.institutofleury.org.br/site/calandra http://www.mostgene.org/gd/gdvol13a.htm http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&amp;pid=S151 6-84842005000200008&amp;lng=en&amp;nrm=iso&amp;tlng=pt http://www.slh.wisc.edu/cytogenetics/procedures/fish/index. php </li> </ul>