Imunochemické metody

  • View
    40

  • Download
    0

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Imunochemick metody. Metody vyuvajc vazbu mezi antigenem a protiltkou. Vytek 2008. Vazba mezi antigenem a protiltkou. Je nekovalentn a podl se na n vodkov mstky a iontov interakce stejn jako van der Waalsovy sly i interakce dipol-dipol - PowerPoint PPT Presentation

Transcript

  • Imunochemick metodyMetody vyuvajc vazbu mezi antigenem a protiltkouVytek 2008

  • Vazba mezi antigenem a protiltkouJe nekovalentn a podl se na n vodkov mstky a iontov interakce stejn jako van der Waalsovy sly i interakce dipol-dipolSlu interakce (vazby) mezi antigenem a protiltkou vyjaduje afinitn konstantaKA = [Ab-Ag] / [Ab].[Ag]

    Afinitn konstanta, tj. sla vazby, je zvisl na pH, iontov sle, ptomnosti detergent i chaotropnch inidel

  • Hlavn imunochemick metodyImunoesejeImunoblotovnImunoprecipitaceImunoafinitn chromatografiImunosensory

  • ImunoesejePrincip metody je zaloen na pidn malho mnostv znaen protiltky nebo antigenu kstudovan smsi antigen-protiltka a stanoven tto znaen komponenty ve vslednm imunokomplexu. Mnostv znaen komponenty vimunokomplexu je zvisl na koncentracch vchozch neznaench komponent. Nezbytnou podmnkou vyuit tchto metod pro analzu antigen je, aby antigen byl rozpustn v pufru zhruba fysiologickho pH, osmolarity a bez detergent rucch vazbu antigen-protiltka.

  • ImunoesejeDle proveden :HomogennHeterogenn jedna z komponent (Ag nebo Ab) je navzna na pevnou fzi

    Dle znaen :Znaen radioisotopem (RIA)Znaen enzymem (EIA)Znaen fluoreskujcmi barvikami

    Znaen pm Znaen nepm asto vyuvan pro znaen protiltky (primrn protiltka je neznaena a pak se pouije druh protiltka ,kter je druhov specifick a nese znaku (tento typ znaen protiltky je bn komern dostupn)

  • Imunoesej s ukotvenm antigenemV zkladn podob se vyuv pro stanoven specifickch Ab proti ukotvenmu antigenu (obvykle s nepmm znaenm)

  • Imunoesej s ukotvenou protiltkou

  • Sandviov imunoesej

  • Oplchnut a inkubace se sekundrn protiltkou vhodn znaenou (enzymem i radioisotopem) Stanoven antigenu kompetetivn EIA s ukotvenm antigenem

  • Koncentrace antigenuKompetetivn EIA na ukotvenm antigenu

  • Imunoblotovn (Western blotting)kombinuje separan innost gelov elektroforesy se specifitou detekce na basi vazby antigen-protiltka semikvantitativn metodaumouje sledovat i antigeny nerozpustn v bnch pufrech

  • Imunoblotovn princip metodyseparace jednotlivch vzork gelovou elektroforesou (obvykle SDS-PAGE)penos rozdlench polypeptid z gelu na vhodnou membrnu (nitrocelulosu)blokovn nespecifickch vazebnch mst membrny inkubace membrny se specifickou protiltkou (primrn protiltkou)inkubace s druhou protiltkou vhodn znaenou (tzv. sekundrn Ab) proti imunoglobulinm zvecho druhu primrn protiltky detekce specifickch antigen pomoc znaen

  • Mapovn epitopu. Imunobloty tryptickch tp COMP 0 mmol/l Ca2+0C, 30 min12.5 mmol/l Ca2+ 37C 6hod12.5 mmol/l Ca2+ 0C, 30 min

  • Densitometrick hodnocen imunoblot COMP ze synoviln tekutiny s temi rznmi monoklonlnmi protiltkami

  • Tvorba precipitujcho imunokomplexu

  • Heidelbergerova precipitan kivka

  • Imunosensoryprincip je podobn heterogenn EIA, ale stanoven imunokomplexu se provd bez znaen komponenty menm elektrickch i optickch zmn na sensoru s navzanm imunokomplexemQCM (quartz crystall microbalance) - pokles frekvence osciltoru s kemennm krystalem je mrn hmot navzan na povrch kemennho krystalu SPR (surface plasmon resonance) - optickho jev vznikajcho na tenkch vrstvch nebo na nanosticch je mrn celkov adsorbovan hmot na povrchu tenk vrstvy i nanostic