Imunologie - Lucrari Practice (3)

  • Published on
    05-Dec-2015

  • View
    27

  • Download
    5

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Imunologie, UMFCV, Silosi Isabela; anul 3 medicina generala

Transcript

  • INTRODUCERE N HISTOCHIMIE I IMUNOHISTOCHIMIE

    Partea a III-a

  • PLANUL PREZENTRII

    Metode de blocare a surselor de semnal fals in IHC

    Detectia fluorescenta a semnalului

  • PLANUL PREZENTRII

    Metode de blocare a surselor de semnal fals in IHC

    Detectia fluorescenta a semnalului

  • Secvena tipic a IHCSecionare a blocului de parafin

    Clarificare (solveni organici)

    Hidratare (alcool n concentraie descresctoare)

    Splare n ap

    Blocarea enzimelor endogene

    Splare n sol. salin

    Blocarea situsurilor antigenice nespecifice

    Blocarea biotinei endogene

    Incubare cu primul anticorp

    Splare n sol. salin

    Incubare cu anticorpul secundar i sistemul de detecie

    Detecia semnalului

    Deshidratarea, clarificarea i acoperirea cu lamela

  • Blocarea enzimelor endogene-Peroxidaza-Peroxidazele contin gruparea HEM ce utilizeaza H2O2 ca acceptor de electroni pentru a cataliza oxidarea substratului (DAB, AEC).Peroxidaza exogene extrasa din hrean.Peroxidazele endogene:Hemoglobina (hematii)Mioglobina (tesut muscular)Citocromi (granulocite, monocite)Catalze (ficat, rinichi)

  • Blocarea enzimelor endogene-Peroxidaza-

  • Blocarea enzimelor endogene-Peroxidaza-

  • Blocarea enzimelor endogene-Peroxidaza-Hemoragie cu reactie nespecifica.

  • Blocarea enzimelor endogene-Peroxidaza-

  • Blocarea enzimelor endogene-Peroxidaza-Blocarea peroxidazei endogene se face prin suprasaturare cu H2O2 1-3% in apa distila sau metanol.

  • Blocarea enzimelor endogene-Peroxidaza-

  • Blocarea enzimelor endogene-Peroxidaza-

  • Blocarea enzimelor endogene-Peroxidaza-

  • Blocarea enzimelor endogene-Fosfataza alcalina-PA (intestin de vitel) muta o grupare P de pe un donor pe un acceptor (ambele componente ale substratului).PA endogena se gaseste in maduva hematogena, vezica urinara si intestin.Blocarea PA se face cu o solutie 5 mM de levamisol.

  • Blocarea enzimelor endogene-Fosfataza alcalina-

  • Blocarea biotinei endogeneBiotina abunda in ficat, rinichi si tesutul limfoid.Vizualizarea biotinei endogene se acentueaza pe sectiunile tratate cu EDTA pH=9.

  • Blocarea biotinei endogene

  • Blocarea biotinei endogene

  • Blocarea biotinei endogene

  • Blocarea biotinei endogene

  • Blocarea biotinei endogene

  • Blocarea biotinei endogene

  • Blocarea biotinei endogene

  • Blocarea biotinei endogene

  • Blocarea biotinei endogene

  • Blocarea biotinei endogeneBiotina poate lega o singura data Avidina sau Streptavidina !!!

  • Blocarea biotinei endogeneIncubare cu streptavidinaSpalare PBSIncubare cu biotinaSpalare PBS

  • Blocarea situsurilor antigenice nespecificeSe realizeaz pentru mpiedicarea legrii nespecifice a anticorpului primar care ar conduce la obinerea unui semnal fals.Inainte de anticorpul primar, se incubeaz lamele 30 min la temperatura camerei cu ser normal al aceleiai specii cu anticorpul secundar, sau cu lapte degresat 1-3%.Nu se spala in PBS inainte de adaugarea anticorpului primar.

  • Blocarea situsurilor antigenice nespecifice

  • Blocarea situsurilor antigenice nespecifice

  • Blocarea situsurilor antigenice nespecifice

  • Blocarea situsurilor antigenice nespecifice

  • Secvena tipic a IHCSecionare a blocului de parafin

    Clarificare (solveni organici)

    Hidratare (alcool n concentraie descresctoare)

    Splare n ap

    Blocarea enzimelor endogene

    Splare n sol. salin

    Blocarea situsurilor antigenice nespecifice

    Blocarea biotinei endogene

    Incubare cu primul anticorp

    Splare n sol. salin

    Incubare cu anticorpul secundar i sistemul de detecie

    Detecia semnalului

    Deshidratarea, clarificarea i acoperirea cu lamela

  • PLANUL PREZENTRII

    Metode de blocare a surselor de semnal fals in IHC

    Detectia fluorescenta a semnalului

  • Detectia fluorescenta a semnaluluiAnticorpii se conjuga cu fluorofori (cromofori) care excitaticu o lumina UV de o lungime de unda, pot emite o lumina UVcu energie mai joasa (cu o lungime de unda mai mare).

  • Detectia fluorescenta a semnalului(in lumina reflectata!!!)

  • Detectia fluorescenta a semnaluluiFluoroforii sunt de obicei compusi fenolici:Cei mai folositi: FITC (verde), Texas Red, CY3 (rosu),DAPI (albastru)

    In ultimii ani au aparut nanocrostale care emit lumina pefrecvente ce depind de dimensiunile lor (nanocristale- Qdots)

  • Detectia fluorescenta a semnalului

  • Detectia fluorescenta a semnalului

  • Detectia fluorescenta a semnaluluiAvantajele IHC in fluorescenta:

    Studiile de colocalizare sunt posibile numai prin fluorescenta.Microscopia confocala si deconvolutia permit colocalizarea si reconstructia 3D reale.Detectia nu interfera cu structurile normale (semnal pur).Markerii fluorescenti se pot urmari si in vivo.

    Dezavantaje:

    Microscop special dotat cu filtre pentru fiecare cromogen.Vizualizarea nespecifica a unor compusi fluorescenti (lipofuscina).

  • Detectia fluorescenta a semnalului

  • Detectia fluorescenta a semnalului

  • Detectia fluorescenta a semnaluluiCD31 Alexa 488Cd20cy Alexa 594Planuri optice realeCD31 Alexa 488Cd20cy Alexa 594Deconvoluie

  • *