isolamento anaerobios

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    31-Oct-2015

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<ul><li><p>UNIVERSIDADE DE SO PAULOINSTITUTO DE CINCIAS BIOMDICASDEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA</p><p>LABORATRIO DE ANAERBIOS</p><p>MTODOS DE ISOLAMENTO E </p><p>IDENTIFICAO DE BACTRIAS </p><p>ANAERBIAS</p><p>Prof. Dr. Mario Julio Avila-CamposHomepage: www.icb.usp.br/bmm/mariojacp g p j</p></li><li><p>ISOLAMENTO DE ANAERBIOS</p><p>9 Para que isolar anaerbios?</p><p>- Conhecer os diferentes tipos microbianos</p><p>- Informao microbiolgica completa e g prpida</p><p>- Identificao dos organismosIdentificao dos organismos</p><p>- Susceptibilidade a antimicrobianos</p></li><li><p>Isolamento de Anaerbios - Espcimes a serem pesquisados</p><p>- Leses associadas ao trato gastrointestinal ou genitalfeminino.- Septicemia.- Infeces crnicas do trato respiratrio superior(sinusites, otite mdia).- Leso supurativa do trato respiratrio inferior(pneumonia)(pneumonia).- Meningites associadas com infeces crnicas do tratorespiratrio superior (fluido crebro-espinal)respiratrio superior (fluido crebro espinal).- Abscessos superficiais e profundos (cerebral).- Infeces dentaisInfeces dentais.- Leses por queimaduras e mordidas.</p></li><li><p>DIFICULDADES NO ESTUDO DA MICROBIOTA ANAERBIA</p><p>9 Tcnicas de coleta, transporte e processamento9 Volume do espcime</p><p>9 Diluente e homogeneizao do espcime9 Diluente e homogeneizao do espcime</p><p>9 Meios seletivos e no seletivos, suplementados</p><p>9 Microbiota associada mucosa</p><p>9 Variaes da dieta, e variao dia a dia da amostragem</p><p>9 Interferncia de Antimicrobianos9 Interferncia de Antimicrobianos.</p></li><li><p>Indcios clnicos de infeco por anaerbios</p><p> Secreo de odor ptrido Infeco na proximidade de mucosa de revestimento. Tecido necrtico, gangrena, formao de pseudomembrana. Gs nos tecidos ou na secreo.</p><p> Endocardites com hemocultura negativo.</p><p> Infeces devidas ao uso de aminoglicosdeos</p><p> Quadro de bacteremia com ictercia.</p><p> Infeces aps mordidas humanas ou animais Infeces aps mordidas humanas ou animais.</p><p> Secreo escura e fluorescentes na UV</p><p> Condies clnicas tais como aborto sptico, infeco aps cirurgia gastro-intestinal, etc.</p></li><li><p>Indcios bacteriolgicos de infeco por anaerbios</p><p> Morfologia singular na colorao de Gram</p><p> Nenhum crescimento em cultura rotineira </p><p>Vestgio de crescimento em aerobiose Vestgio de crescimento em aerobiose</p><p> Crescimento em 100 g/ml de canamicina ou Crescimento em 100 g/ml de canamicina ouneomicina, ou 7,5 g/ml de vancomicina.</p><p>C / Cultura com produo de gs e/ou odor ptrido</p><p> Colnias fluorescentes sob UV (P. melaninogenica, F. Colnias fluorescentes sob UV (P. melaninogenica, F.nucleatum</p></li><li><p>MTODOS DE COLETAS E </p><p>TRANSPORTE DE </p><p>ESPCIMES CLNICOSESPCIMES CLNICOS</p></li><li><p>sondagem</p><p>coletacoleta</p><p>Coleta em ces com d i d t ldoena periodontal</p></li><li><p>Coleta de leso periodontalperiodontal</p></li><li><p>Coleta de polpa necrtica e tecido </p><p>periimplantar.</p></li><li><p>Espcime clnico do duodeno</p><p>Espcimes de ala intestinalp </p></li><li><p>Mini-jarra (Tcnica do bombril com CuSO4)Mini jarra (Tcnica do bombril com CuSO4)</p></li><li><p>Soluo Ringer-PRAS</p><p>Meio VMGA III</p></li><li><p>Coleta e transporte de espcimes clnicosespcimes clnicos</p></li><li><p>MTODOS DE OBTENO DE ANAEROBIOSE</p><p>1. SUBSTNCIAS REDUTORAS- Placas de Brewer- Placas de Brewer- Jarras com catalizadores de H2 - Paladium (Gaspak)- Absoro pelo PirogalolAbsoro pelo Pirogalol</p><p>2. CONSUMO BIOLGICO DO OXIGNIO LIVRE- Tcnica de Fortner</p><p>3. PROCESSO MECNICO DE MISTURA DE GASES3. PROCESSO MECNICO DE MISTURA DE GASES</p><p>- 90% N2 + 10% CO2; 5% H2 + 85% N2 + 10% CO2</p><p>4. ESTUFAS E CMARAS DE ANAEROBIOSE</p></li><li><p>Processo mecnico de </p><p>bt dobteno de anaerobiose por mistura gasosa g</p><p>(90% N2 /10% CO2)</p></li><li><p>Jarra de Anaerobiose</p></li><li><p>Cmara de Anaerobiose</p></li><li><p>Isolamento eIsolamento e Identificao</p></li><li><p>Esquema de isolamento e identificao</p><p>E i GEspcime Gram</p><p>Diluies</p><p>ISOL</p><p>Meio seletivo No </p><p>seletivo</p><p>TioglicolatoLAME</p><p>Colnia caractersticaAnaerobiose</p><p>GramMeio no </p><p>NTO</p><p>Cultura puraseletivo</p><p>Teste respiratrio GramCA Teste respiratrio Gram</p><p>EstocagemTestes presuntivos</p><p>RACT</p><p>Testes definitivosBioqumica</p><p>Imunolgicos Susceptibilidade a antimicrobianos</p><p>Biologia molecular: sondas, PCR...Cromatografia gasosa</p><p>ERI.</p></li><li><p>Isolamento e meios de cultivo</p><p>Prevotella Fusobacterium BacteroidesPorphyromonas</p><p>Meios Meios seletivos</p><p>gar sangue com canamicina Omata-Disraely</p><p>BBE</p><p>Perodo de incubao 7-14 dias 3-5 dias</p><p>3-5 dias</p><p>Tempo de exposio 1 hora 3 horas 72 horas</p><p>ao ambiente</p></li><li><p>Identificao Bacteriana Presuntiva</p><p>Prevotella</p><p>PorphyromonasFusobacterium Bacteroides</p><p>Porphyromonas</p><p>Gram</p><p>Fl i</p><p>Gram</p><p>Hid li li</p><p>Gram</p><p>Hidrlise esculinaTestes presuntivos</p><p>Fluorescncia</p><p>Hidrlise amido e esculina</p><p>Hidrlise esculina</p><p>SIM</p><p>Hidrlise esculina</p><p>Produo de gs</p><p>SIMSIM</p><p>SIM</p><p>F d F d</p><p>Testes definitivos</p><p>Fermentao de acares</p><p>Kits comerciais</p><p>Fermentao de acares</p><p>Kits comerciais</p><p>Fermentao de acares</p><p>Kits comerciais</p><p>Testes moleculares Testes moleculares Testes moleculares</p></li><li><p>TESTES PRESUNTIVOS</p><p>9 Colorao de Gram: morfologia celular</p><p>9 Morfologia colonial</p><p>9 Pigmentao natural ou luz UV</p></li><li><p>B. fragilis</p><p>F. nucleatum</p></li><li><p>C lt d b t i d t d i tCultura pura de bactrias produtoras de pigmento negro</p></li><li><p>C. Perfringens : Dupla hemlise</p><p>C. difficile: CCFA - cicloserina, cefoxitina, frutose, gar. g</p></li><li><p>TESTES DEFINITIVOS</p><p>9 Aspectos bioqumicos e FisiolgicosAspectos bioqumicos e Fisiolgicos</p><p>9 Imunolgicos9 Imunolgicos</p><p>9 Cromatografia gasosa</p><p>9 Biologia molecular: sondas, PCR, sequenciamento</p><p>9 Susceptibilidade a drogas antimicrobianas</p><p>Biologia molecular: sondas, PCR, sequenciamento</p><p>9 Susceptibilidade a drogas antimicrobianas</p></li><li><p>Sistema Mini-API 32-A (bi M i )(bioMrieux)</p></li><li><p>Cromatgrafo gasosogasoso</p></li><li><p>CARACTERIZAO MICROBIANA</p><p>Caractersticas fenotpicas</p><p>Estabilidade influenciada pela presso seletiva do meio ambiente</p><p>Identificao pouco precisa ou especfica</p></li><li><p>CARACTERIZAO MOLECULAR</p><p>9 REA: anlise com enzima de restrio</p><p>9 Hibridizao usando sondas de DNA ou RNA</p><p>9 PFGE l t f l l d</p><p>9 RFLP: polimorfismo tamanho fragmentos restrio</p><p>9 Polymerase Chain Reaction (PCR)</p><p>9 PFGE: eletroforese gel em campo pulsado</p><p>9 Polymerase Chain Reaction (PCR)</p><p>9 Sequenciamento</p></li><li><p>Mtodos Moleculares</p><p>9 Especificidade e sensibilidade</p><p>9 Rapidez e facilidade</p><p>9 Deteco e identificao simultneas</p><p>9 Custo</p><p>9 rea fsicarea fsica</p></li><li><p>CARACTERIZAO MOLECULAR</p><p>Reao em cadeia da polimerase (PCR)</p><p>(Dcada de 80)</p><p>Deteco de genes alvosDeteco de genes alvos</p><p>Rapidez diagnstico de doenas infecciosas e facilitou estudos epidemiolgicos</p></li><li><p>Reao em Cadeia da Polimerase - PCR</p><p>9 Detecta pequenas quantidades de DNA bacteriano (ng)9 Detecta pequenas quantidades de DNA bacteriano (ng)mesmo em amostras mistas;</p><p>9 Permite amplificao de pouco DNA para gerargrandes q antidades do mesmo;grandes quantidades do mesmo;</p><p>9 Pode detectar microrganismos em espcimes clnicosestocados;</p></li><li><p>Reao em Cadeia da Polimerase - PCR</p><p>9 Viabilidade microbiana no necessria para aViabilidade microbiana no necessria para aidentificao;</p><p>9 Identifica e distingue organismos com altasimilaridade fenotpica e genotpica;</p><p>9 Detecta organismos difceis de distinguir por cultivo</p><p>similaridade fenotpica e genotpica;</p><p>9 Detecta organismos difceis de distinguir por cultivotradicional ou no cultivveis.</p></li><li><p>Alguns genes estudados em anaerbios de relevncia clnica</p><p>Organismos Genes Metodologia</p><p>bft (bft1, bft2, bft3) PCR; Multiplex-PCR</p><p>B. fragilis nanH PCR; Nested-PCRcepA PCR; AP-PCR; PFGEcfiA/ccrA PCR; AP-PCR; PFGEcfiA/ccrA PCR; AP-PCR; PFGEcfxA PCR; AP-PCR; PFGE</p><p>C. difficilePaLoc (tcdA/tcdB)Toxina binria (cdtA/cdtB)</p><p>PCR; SequenciamentoPCR</p><p>fliC PCR</p><p>P i i li prtC PCRP. gingivalis prtC PCRfimA PCR; Sequenciamento</p></li><li><p>ETBF: subtipos do gene bft (bft1, bft2, bft3)</p><p>1 2 3 4 5 6 7 8 bp287 (bft3)</p><p>190 (bft1)175 (bft2)</p><p>Colunas 1, 2, 3 e 5: cepas P13C, P60A, P60C e P60F (bft1 e bft3);Colunas 1, 2, 3 e 5: cepas P13C, P60A, P60C e P60F (bft1 e bft3);coluna 4, cepa B. distasonis; colunas 6 e 7: cepa GAI 97124 e ATCC43858 (bft2 e bft3); coluna 8: 50 bp.</p><p>Multiplex-PCR.</p></li><li><p>H ainda muito que estudar no que seH ainda muito que estudar no que se </p><p>refere estrutura genmica de bactrias </p><p>anaerbias, e certamente as tcnicas </p><p>l l i l i d lmoleculares incluindo a clonagem e </p><p>sequenciamento devero contribuir para o </p><p>esclarecimento das dvidas, ainda existentes </p><p>nesse grupo microbiano</p></li><li><p>Consideraes finais</p><p>9 Grupo importante e predominante em ecossistemashumanos, animais e ambientais;</p><p>9 Propicia equilbrio e manuteno de ecossistemas:tilid d t bli d t bilid d fi i l iversatilidade metablica e adaptabilidade fisiolgica;</p><p>9 Participa de infeces mistas de natureza endgena;</p><p>9 No recebe a importncia clnica necessria;</p><p>p g ;</p><p>9 Poucos so os grupos que estudam esses organismos:t f t i t iaspectos fenotpicos e genotpicos.</p></li></ul>