LIBRO Fundamentos de La Espectroscopia UV-Vis

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    10-Jul-2015

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Fundamentos de la espectroscopa UV-visible modernaConceptos bsicos

Tony Owen

Copyright Agilent Technologies 2000 Todos los derechos reservados. Esta prohibida la reproduccin, adaptacin o traduccin, sin el permiso previo y por escrito, excepto aquello permitido por la ley de Derechos de Autor. Impreso en Alemania 06/00 Nmero de publicacin 5980-1397ES

Prlogo

Prlogo

En 1988 publicamos un libro titulado The Diode-Array Advantage in UV/Visible Spectroscopy. En ese momento, aunque los detectores de diodos estaban en el mercado desde 1979, sus caractersticas y sus ventajas comparados con los espectrmetros convencionales de barrido, no eran demasiado conocidas. Nosotros intentamos rectificar aquella situacin. El libro fue bien recibido y se distribuyeron varios miles de copias. Mucho ha cambiado desde aquel primer libro y pensamos que este es un momento adecuado para otra publicacin. Ha aumentado el uso de los ordenadores en la evaluacin de datos; las Buenas Prcticas de Laboratorio tienen ahora gran importancia; y la nueva generacin de espectrofotmetros de diodos se caracteriza por un mejor rendimiento. Con este libro, nuestro objetivo es revisar todos los aspectos de importancia de la espectroscopa UV-visible, para la obtencin de resultados. El control por microprocesador y/u ordenador hace que el proceso de datos sea menos penoso y mejora la productividad. Como fabricantes de instrumentos, nos gustara creer que los equipos son ahora ms fciles de manejar. A pesar de estas ventajas, el conocimiento de los fundamentos de la espectroscopa UV-visible, de las limitaciones instrumentales y de los peligros del tratamiento y la qumica de muestras, sigue siendo esencial para obtener buenos resultados. Adems, quisieramos demostrar que la idea de una medida a una sola longitud de onda es insuficiente para obtener resultados ptimos. Mltiples medidas a mltiples longitudes de onda o (preferiblemente) espectros completos, dan lugar a la mejor exactitud y precisin de resultados y proporciona la informacin necesaria para detectar errores. Me gustara aprovechar esta oportunidad para agradecer a mis colegas de Agilent Technologies, demasiados para nombrarlos a todos, todo lo que he aprendido de ellos sobre espectroscopa UV-visible, durante aos.

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Contenidoscaptulo 1 Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visiblePrincipios bsicos................................................................................................ 2 El espectro electromagntico.................................................................... 2 Longitud de onda y frecuencia .................................................................. 3 Origen de los espectros UV-visible ........................................................... 3 Transmitancia y absorbancia..................................................................... 6 Derivadas de espectros .............................................................................. 6 Obtener las derivadas de los espectros ........................................... 8 Aplicaciones ........................................................................................ 9 Seal/ruido .......................................................................................... 9 Consideraciones instrumentales .................................................... 10 Anlisis cualitativo ............................................................................................ 10 Identificacin: espectros y estructura .............................................................................. 10 Confirmacin de la identidad .................................................................. 11 Color ........................................................................................................... 13 Otra informacin cualitativa.................................................................... 14 Temperatura de fusin de las protenas y los cidos nuclicos . 14 Actividad enzimtica ........................................................................ 15 Consideraciones instrumentales ............................................................. 16 Anlisis cuantitativo.......................................................................................... 16 Ley de Beer ................................................................................................ 16 Requisitos de la muestra.................................................................. 20 Anlisis multicomponente ....................................................................... 21 Principio de aditividad ..................................................................... 21 Mtodo de ecuaciones simultneas simples ................................. 21 Mtodo de mnimos cuadrados....................................................... 24 Otros mtodos................................................................................... 26 Requisitos de la muestra.................................................................. 27 Requisitos instrumentales........................................................................ 27 Cuantificacin indirecta ................................................................................... 28 Derivatizacin qumica............................................................................. 28 Valoraciones espectrofotomtricas ........................................................ 28 Ensayos cinticos enzimticos................................................................ 28

captulo 2 InstrumentacinDiseo instrumental .......................................................................................... 32 Componentes............................................................................................. 32 Fuentes .............................................................................................. 33

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Contenidos

Dispositivos de dispersin .............................................................. 34 Detectores ......................................................................................... 35 Optica ................................................................................................. 38 El espectrofotmetro convencional ....................................................... 38 El espectrofotmetro de diodos.............................................................. 39 Configuracin ............................................................................................ 41 Diseo de haz simple ....................................................................... 41 Diseo de doble haz ......................................................................... 42 Diseo con divisin de haz.............................................................. 44 Diseo de doble longitud de onda ............................................................................... 45 Medida de un espectro ............................................................................. 45 Parmetros instrumentales clave .................................................................... 46 Resolucin espectral ............................................................................... 46 Exactitud y precisin de longitud de onda ............................................ 50 Exactitud y precisin fotomtrica .......................................................... 51 Luz dispersa....................................................................................... 51 Ruido .................................................................................................. 52 Rango dinmico lineal .............................................................................. 53 Deriva ......................................................................................................... 55

captulo 3 Tratamiento y medida de muestraMuestras lquidas ............................................................................................... 58 Cubetas....................................................................................................... 58 Material .............................................................................................. 58 Tipos de cubeta................................................................................. 59 Fuentes de error ............................................................................... 60 Cuidado de las cubetas .................................................................... 61 Eleccin de disolvente ............................................................................. 61 Efecto del disolvente, concentracin, pH y temperatura .................... 62 Muestras slidas ................................................................................................ 64 Sin referencia............................................................................................. 64 Indice de refraccin.................................................................................. 65 Geometra de la muestra .......................................................................... 65 Absorbancia dbil.............................................................................................. 66 Cambiar la anchura de rendija.................................................................................................... 66 Promedio de tiempo ................................................................................. 67 Promedio de longitud de onda ................................................................ 67 Absorbancia fuerte ............................................................................................ 68 Interferencia....................................................................................................... 69 Tipos de interferencia............................................................................... 69 Otros compuestos absorbentes