Metode experimentale avansate

  • Published on
    17-Nov-2015

  • View
    91

  • Download
    6

Embed Size (px)

DESCRIPTION

nano

Transcript

<ul><li><p>3 </p><p>Editori Mihaela Alua Simion Simon </p><p>METODE EXPERIMENTALE AVANSATE PENTRU </p><p>STUDIUL I ANALIZA BIO-NANO-SISTEMELOR </p><p>Casa Crii de tiin Cluj-Napoca, 2012 </p></li><li><p>4 </p><p> Coperta: Patricia Puca Editur acreditat CNCSIS (24) Universitatea Babe-Bolyai, 2012 Material editat n cadrul proiectului Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar, ID 36154 Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei Metode experimentale avansate pentru studiul i analiza bio-nano- sistemelor / ed.: Mihaela Alua, Simion Simon. - Cluj-Napoca : Casa Crii de tiin, 2012 Bibliogr. ISBN 978-606-17-0115-5 I. Alua, Mihaela (ed.) II. Simon, Simion (ed.) 53 </p></li><li><p>5 </p><p>Prefa </p><p>n calitate de director al proiectului cu titlul Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar, cod contract POSDRU/21/1.5/G/36154, doresc s mulumesc tuturor colaboratorilor care au contribuit prin expertiza i pro-fesionalismul lor la realizarea acestui volum i, implicit, la dezvoltarea pro-gramului doctoral. </p><p>Mulumirile mele se ndreapt de asemenea ctre echipa de management a proiectului, n urmtoarea componen: </p><p>Prof. dr. Simion Simon, coordonator tiinific program doctoral </p><p>Prof. dr. Octavian Popescu, coordonator tiinific relaii internaionale </p><p>Cristina Dominic, asistent manager </p><p>Andra Ghira, responsabil logistic i asistent manager </p><p>Jr. Alexandru Braoveanu, consilier juridic </p><p>Ec. Gelu Silviu Moldovan, responsabil financiar </p><p>Ing. Carmen Ciplea, expert IT </p><p>Ec. Istvn Psk, expert contabil </p><p>Am convingerea c informaia cuprins n aceast lucrare va sprijini gene-raiile prezente i viitoare de conductori de doctorat n activitatea lor de cercetare. De asemenea, va facilita orientarea doctoranzilor n lumea minu-nat a tiinei contribuind la determinarea acestora de a face din meseria de cercettor o vocaie. </p><p>Proiectul Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar, cod contract POSDRU/21/1.5/G/36154, a fost cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013. </p><p> C.S.III. dr. Mihaela ALUA </p></li><li><p>6 </p></li><li><p>7 </p><p> Cuvnt nainte </p><p> Institutul de Cercetri Interdisciplinare a fost nfiinat prin Hotrrea Sena-</p><p>tului Universitii Babe-Bolyai din data de 30.05.2001, ca unitate de cercetare i transfer tehnologic, avnd ca obiectiv de activitate att realizarea de studii i cercetri interdisciplinare n domeniile biologie molecular, biomateriale i sisteme biologice, materiale avansate i mediu ambiant, sisteme nanostructurate natural i artificial, ct i transferul rezultatelor obinute ctre beneficiari locali, naionali sau internaionali. Institutul beneficiaz de o cldire proprie, cu o suprafa desfurat de peste 3000 mp, modernizat la nivelul standardelor internaionale din punct de vedere al dotrilor conexe i avnd laboratoare de cercetare structurate n acord cu nevoile cercetrilor interdisci-plinare menionate. ntre timp institutul, prin efortul conjugat al celor care au decis s-i dedice energia i cunotinele cercetrilor la interfaa Bio-Nano-Sistemelor, a devenit Institutul de Cercetri Interdisciplinare n Bio-Nano-tiine (ICI-BNS). n cadrul acestuia i desfoar activitatea n prezent 12 profesori universitari (dintre care 10 conductori de doctorat), 25 alte cadre didactice i cercettori i peste 40 de doctoranzi cu frecven. Acetia aparin domeniilor Fizic, Chimie, Biologie, Informatic, tiina mediului i Psihologie. </p><p>Proiectul Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar a oferit posibilitatea de a mobiliza un set de cercettori valoroi, cu experien deosebit n tehnicile experimentale frecvent utilizate n cercetrile interdisciplinare din domeniul Bio-Nano-tiinelor. </p><p>Marea majoritate a experilor a beneficiat de stagii doctorale sau postdoc-torale n prestigioase laboratoare din lume unde au dobndit o bogat experi-en n utilizarea echipamentelor de nalt performan de care dispune Insti-tutul nostru. </p><p>Studenii doctoranzi, dar i specialiti din domenii ca: fizic, chimie, biologie, geologie sau tiina mediului interesai n studii experimentale interdisciplinare vor gsi n materialele incluse n prezentul volum date teoretice dar mai ales prac-tice, despre tehnici experimentale avansate prezentate ntr-o form accesibil, cu exemple semnificative, menite a facilita nelegerea fenomenelor studiate i a con-tribui la creterea aportului fiecrui cercettor la dezvoltarea domeniului n care i va desfura activitatea tiinific. </p><p>Prof. Dr. Simion SIMON Director ICI-BNS </p></li><li><p>8 </p></li><li><p>9 </p><p> CUPRINS </p><p> I. ANALIZE GENETICE ................................................................................................. 13 </p><p>Clonarea i exprimarea genelor o metod excepional pentru obinerea de proteine .......................................................................................................................... 13 </p><p>Asist. univ. dr. Iulia Lupan Aplicaii ale tehnicilor de biologie molecular n studii interdisciplinare ........... 36 </p><p>Asist. univ. dr. Iulia Lupan </p><p>II. CULTURI CELULARE ............................................................................................... 64 Culturi celulare ........................................................................................................... 64 </p><p>Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac Culturi celulare partea a II-a .................................................................................... 82 </p><p>Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac </p><p>III. MICROSCOPUL CONFOCAL RAMAN ............................................................ 101 Microspectroscopia Raman ....................................................................................... 101 </p><p>Conf. dr. Monica Maria Baia Microspectroscopia Raman partea a II-a ................................................................ 121 </p><p>Conf. dr. Monica Maria Baia </p><p>IV. SPECTROMETRUL IR ........................................................................................... 134 Spectroscopia de absorbie n infrarou .................................................................. 134 </p><p>Lect. dr. Nicolae Leopold Tendine moderne n spectroscopia de absorbie IR ............................................. 147 </p><p>Lect. dr. Nicolae Leopold </p><p>V. SPECTROFLUORIMETRUL .................................................................................. 160 Spectrofluorimetria .................................................................................................... 160 </p><p>Conf. dr. Dana Maniu Spectrofluorimetria - aplicaii ................................................................................... 172 </p><p>Conf. dr. Dana Maniu </p><p>VI. SPECTROMETRUL DE REZONAN MAGNETIC NUCLEAR ......... 191 Spectroscopie de rezonan magnetic nuclear pe solide (RMN-S) .................. 191 </p><p>C.S.I. dr. Claudiu Filip, C.S.III. dr. Mihaela Alua Spectroscopie de rezonan magnetic nuclear pe solide (RMN-S) Implemen-tarea de metode avansate RMN-S pentru aplicaii pe sisteme moleculare organi-ce n faza solid .......................................................................................................... 216 </p><p>C.S.I. dr. Claudiu FILIP, C.S.III. dr. Mihaela Alua </p></li><li><p>10 </p><p>Rezonana magnetic nuclear pe sisteme lichide ................................................ 246 Lect. dr. Mihai Vasilescu </p><p>VII. MSURTORI TERMICE .................................................................................. 266 Analiz termic diferenial. Analiz calorimetric diferenial ......................... 266 </p><p>Conf. dr. Raluca Ciceo-Luccel Ghid de utilizare a aparatelor de analiza termic diferenial si analiz calori-metric diferenial. Ghid de interpretare a msurtorilor DTA/TG i DSC........................................................................................................................... 275 </p><p>Conf. dr. Raluca Ciceo-Luccel </p><p>VIII. DIFRACTOMETRUL DE RAZE X ................................................................... 286 Difracie de raze X pe pulberi ................................................................................... 286 </p><p>C.S.I. dr. Gheorghe Borodi Determinarea structurii cristaline prin difracie de raze X ................................... 305 </p><p>C.S.I. dr. Gheorghe Borodi </p><p>IX. MICROSCOPUL ELECTRONIC DE BALEAJ I DE TRANSMISIE ........... 327 Microscopia electronic ............................................................................................. 327 </p><p>ef lucrri dr. Lucian Barbu-Tudoran Microscopia electronic - partea a II-a .................................................................... 347 </p><p>ef lucrri dr. Lucian Barbu-Tudoran </p><p>X. MICROSCOPUL DE FOR ATOMIC ............................................................ 365 Microscopia de for atomic ................................................................................... 365 </p><p>Conf. dr. Ioan Burda Microscopia de for atomic partea a II-a ........................................................... 378 </p><p>Conf. dr. Ioan Burda </p><p>XI. SPECTROMETRUL DE FOTOELECTRONI DE RAZE X I ULTRAVIOLETE .......................................................................................................... 394 </p><p>Spectroscopia fotoelectronic ................................................................................... 394 C.S.III. dr. Maria Teodora Radu </p><p>Studiul prin spectroscopie fotoelectronic de raze X a suprafeelor diferitelor tipuri de materiale ................................................................................... 424 </p><p>C.S.III. dr. Teodora Maria Radu, C.S.dr. Emilia Sabina Varga </p><p>XII. SPECTROMETRUL DE REZONAN ELECTRONIC DE SPIN .......... 437 Spectroscopia de rezonan electronic de spin ................................................... 437 </p><p>C.S. dr. Milica Todea Spectroscopia de rezonan electronic de spin partea a II- a ............................ 452 </p><p>C.S. dr. Milica Todea </p></li><li><p>11 </p><p>XIII. METODE ELECTROCHIMICE ......................................................................... 467 Elaborarea, testarea i verificarea protocoalelor de practic experimental pentru echipamente de investigare prin metode electrochimice ........................ 467 </p><p>Conf. dr. ing. Graziella Liana Turdean Electrochimia unei substane cu potenial biologic activ. Studiu de caz ............ 490 </p><p>Conf. dr. ing. Graziella Liana Turdean </p><p>XIV. SISTEME DE ANALIZ A SUPRAFEEI SPECIFICE I A DIMENSIUNII PARTICULELOR .......................................................................... 509 </p><p>Sisteme de analiz a suprafeei specifice i a dimensiunii particulelor ............. 509 Lect. dr. ing. Rka Barabs </p></li><li><p>12 </p></li><li><p>13 </p><p> I. ANALIZE GENETICE </p><p> Clonarea i exprimarea genelor o metod excepional </p><p>pentru obinerea de proteine Asist. univ. dr. Iulia Lupan </p><p>Cuprins </p><p>1. Prezentarea principiilor metodei de clonare i exprimare a genelor n sistem procariot ................................................................................................................. 13 </p><p>2. Utilizarea clonrii de gene i exprimrii de proteine recombinate n studii interdisciplinare ..................................................................................................... 31 </p><p>3. Infrastructura existent n cadrul Centrului de Biologie Molecular ................... 33 4. Bibliografie ............................................................................................................. 34 </p><p> 1. Prezentarea principiilor metodei de clonare i exprimare a genelor n sistem procariot </p><p>ADN n sine are doar 2 funcii importante i anume pstrarea informa-iei genetice i furnizarea acesteia pentru sinteza de proteine. Pstrarea in-clude transmiterea materialului genetic nemodificat de la o generaie la alta. Acest fapt este realizat prin replicarea ADN i mprirea egal a celor dou copii n timpul diviziunii celulare. A doua funcie este legat de desci-frarea informaiei pentru sinteza de proteine. Mesagerul informaiei ntre ADN i proteine este ARN, care este sintetizat n procesul de transcriere a ADN de ctre o enzim numit ARN polimeraz. ARNm rezultat servete ca matri n procesul de traducere a ADN (sinteza proteinelor) care are loc n ribozomi. Practic ARN este cruul informaiei din nucleu n citoplasm unde are loc sinteza proteinelor. Dogma central a biologiei presupune transmiterea unidirecional a informaiei de la ADN la proteine prin in-termediul ARN (Figura 1). Informaia genetic nu poate fi transmis invers, de la proteine la ADN. Informaia genetic poate fi transmis de la ARN la ADN n cazul retrovirusurilor la care materialul genetic este ARN. Nu exis-t cazuri de transmitere a informaiei de la ADN direct la proteine. </p></li><li><p>14 </p><p>Clonarea genelor const n izolarea unei gene dintr-un genom i introducerea ei n alte celule gazd pentru multiplicare i n unele cazuri pentru exprimare. Prin multiplicarea celulelor cu genele clonate se pot obine mili-oane de copii ale unei singure gene. Sumar, procesul clonrii const din urmtoarele etape: </p><p> amplificarea genei de interes introducerea genei de interes </p><p>ntr-un vector de clonare introducerea moleculelor recombi-</p><p>nate n celule gazd selecia celulelor transformate (pur-</p><p>ttoare ale moleculei recombinate) verificarea moleculelor recombinate </p><p> Amplificarea genei de interes. O gen este considerat orice fragment </p><p>de ADN care se transcrie ntr-o molecul de ARN. Moleculele de ARN re-zultate n urma transcrierii pot fi mprite n 2 categorii: </p><p> ARN funcional ARN informaional </p><p>ARN funcional este ARN care nu se traduce, ndeplinete anumite funcii n celul (n cea mai mare parte particip la procesul de traducere) i ocup cea mai mare parte din ARN total din celul: ARN ribosomal (ARNr) i ARN de transport (ARNt). </p><p>ARN informaional este ARN mesager (ARNm) care codific un polipeptid i servete ca matri n procesul de traducere (sintez a proteine-lor). De cele mai multe ori genele de interes care sunt scopul clonrii codific un polipeptid. n alte cazuri scopul clonrii nu este obligatoriu o gen, ci un fragment de ADN care nu poate fi separat dintr-un amestec heterogen de molecule apropiate ca mrime. Din aceast cauz n continuare se va utiliza doar termenul fragment ADN de interes pentru a evita confuziile. </p><p>Deoarece fragmentul ADN de interes sau int se afl ntr-un genom este necesar extragerea acestuia. Exist 2 modaliti de a obine fragmentul dorit, fie prin tierea acestuia din genom, fie prin copierea acestuia. Tierea fragmentului din genom este mai dificil deoarece necesit prezena unor situsuri (secvene specifice) la capetele fragmentului, care necesit apoi o izolare din amestecul de fragmente generate, iar numrul moleculelor deci i cantitatea de ADN este mic. </p><p>A doua opiune de copiere a fragmentului din genom este cea mai des </p><p>Figura 1. Dogma central a biologiei.</p></li><li><p>15 </p><p>utilizat. n acest scop se utilizeaz tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction). Aceast tehnic poate fi considerat un adevrat copiator de gene. Tehnica este pe larg utilizat, este rapid i sensibil deoarece necesi-t cantiti foarte...</p></li></ul>