Protocollo di binding (tipo 1) ([crescenti] di radioattivo R [R] R [3R] R R [10R] R R R [30R] R R R R R + tutti i non-specifici rispettivi

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    01-May-2015

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  • Protocollo di binding (tipo 1) ([crescenti] di radioattivo R [R] R [3R] R R [10R] R R R [30R] R R R R R + tutti i non-specifici rispettivi
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  • Binding R R R SeparazioneFiltrazione, centrifugazione ligando radioattivo tessuto, membrane R Quantificazione
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  • Concentrazione di Farmaco radioattivo Radioattivita legata Radioattivita legata in presenza di 10 M di farmaco non radioattivo Radioattivo: 100 Ci/mmol 50 g/tubo Dati sperimentali
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  • I due tipi di binding: tipo I e tipo II SaturazioneCompetizione [X*] [3X*] [X*]
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  • Protocollo di binding (tipo 2) Radioattivo fisso e [crescenti] di spiazzante non radioattivo R [R] R R R R R [R] + F R R R R [R] + 10F [R] +1000F R R R R Non specifico Perche utilizzare questo protocollo???
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  • Esempio di binding (II) CONCENTRAZIONE DI RADIOATTIVO COSTANTE; INCREMENTO DI SPIAZZANTE Curva di inibizione
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  • A* + R ARB + R BR K A = [AR] [A][R] K B = [BR] [B][R] [AR] = K A [A][R][BR] = K B [B][R] R T = [R] + [AR] + [BR] = [R] + K A [A][R] + K B [B][R] = [R](1+ K A [A] + K B [B]) [R] = (1+ K A [A] + K B [B]) RTRT [AR] = K A [A]R T (1+ K A [A] + K B [B]) [AR] R T K A [A] (1+ K A [A] + K B [B]) =
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  • [AR] RT K A [A]R T (1+ K A [A] + K B [B]) = 0.5 IC 50 Se K A e K B sono uguali: K A = 1 + K B [B]* IC 50 K A = 1 IC 50 - D*
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  • Esempio di binding (II) Legame specifico: 3500 - 500 = 3000 N.S. Legame a 0.1 nM di radioattivo D* = 0. 1 nM IC 50 = 0.2 nM K A = 1 IC 50 - D* DR RT [D*]K A [*D]K A + 1 = Una delle prime formule che abbiamo visto!! Possiamo usare questa formula perch K a = K b
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  • Proviamo LNAADP e un possibile secondo messaggero. Per dimostrare che possiede recettori specifici intracellulari, e stato sintetizzato [ 32 P]NAADP ad una attivita specifica di 800 Ci/mmol. Il binding e stato fatto con concentrazione fissa di [ 32 P]NAADP (50 pM),100 g di proteina e concentrazioni crescenti di NAADP. [NAADP] pM DPM
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  • IC 50 = (2500-100)/2 = 1200 quindi 500 pM Kd = 500 - 50 = 450 pM Ka = 2.222.222.222 Legame specifico = 2500 - 100 = 2400 DR RT [D*]K A [*D]K A + 1 = 2400 RT (50*10 -12 )*2.2*10 9 + 1 = (50*10 -12 )*2.2*10 9 = 24000 dpm
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  • In laboratorio vi viene chiesto, dietro compenso, di provare due nuovi composti per valutarne laffinita sui recettori muscarinici. Utilizzate 5 nM carbacolo radioattivo (attivita specifica 2 Ci/mmol) Che affinita hanno i due composti nel vostro preparato? In un ultimo esperimento provate A + B (entrambi 10 M) e misurate 350 DPM legati.Cosa ne potete dedurre? Che altri esperimenti potete disegnare per caratterizzare i due composti?
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  • IC 50 = 20 nM IC 50 = 1.5 nM IC 50 = 100 nM K A = 1 IC 50 - D* K A = 1 + K B [B]* IC 50 e la Bmax???????
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  • DR RT [D*]K A [*D]K A + 1 = DR = 2450 D* = 5 nM K A = 66666667 M -1
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  • Competizione su due siti (cosa potrebbe succedere)
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  • Saturazione su due siti DR D DR
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