Relatório G5

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  • DETERMINAO DAS CONSTANTES CINTICAS DA

    INVERTASE EM CLULAS LIVRES E IMOBILIZADAS EM

    ALGINATO

    Alunos:

    Ana Miranda, n25264

    ngela Marques, n24141

    Cludia Lima, n25267

    28 Maro 2014

    Alunos:

    MESTRADO EM BIOENGENHARIA

    LABORATRIOS DE BIOPROCESSOS

    MDULO 1

    DOCENTE: LGIA RODRIGUES

    Universidade do Minho

    Escola de Engenharia

    Trabalho prtico 1

  • [INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

    1

    ndice

    Sumrio ............................................................................................................................. 2

    Introduo ........................................................................................................................ 3

    Cintica Enzimtica ...................................................................................................... 4

    Influncia da temperatura e do pH na actividade enzimtica ................................... 6

    Imobilizao de enzimas .............................................................................................. 8

    Material e Mtodos ........................................................................................................ 11

    Resultados e Discusso ................................................................................................... 13

    Concluso........................................................................................................................ 21

    Bibliografia ...................................................................................................................... 22

    Anexos ............................................................................................................................ 23

  • [INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

    2

    Sumrio

    Diversas abordagens so usadas no estudo do mecanismo de aco de enzimas, mas a

    abordagem principal determinar a taxa da reaco enzimtica.

    Neste trabalho experimental o objectivo era estudar a cintica da enzima invertase da

    Saccharomyces cerevisiae, livre e imobilizada em esferas de alginato de sdio, ou seja,

    determinar o valor da velocidade mxima (mxima velocidade a que a enzima degrada

    o substrato) e determinar o valor do Km que uma medida da afinidade enzimtica

    para o substrato (essa afinidade igual a 1/km). Se Km for elevado a afinidade baixa.

    A invertase uma enzima que catalisa a degradao da sacarose em glucose e frutose

    (Sacarose + H2O Glucose + Frutose).

    Inicialmente, recorreu-se ao mtodo de DNS que, atravs de uma reta de calibrao,

    permite calcular a concentrao de acar invertido e observar como esta afeta a

    atividade enzimtica. Obteve-se a absorvncia e a concentrao dos acares

    redutores (tendo-se feito cinco ensaios), de seguida calculou-se a velocidade de reao

    para cada concentrao inicial de sacarose. Posteriormente colocaram-se estes

    resultados num grfico (velocidade de reao x concentrao de sacarose), obtendo-se

    uma curva de Michaelis-Menten. Esta curva descrita pela equao que leva o mesmo

    nome.

    Este trabalho teve tambm como obejctivo verificar a existencia de limitaes

    transferencia de massa interna e determinar os factores de eficincia, assim como a

    difusividade da sacarose no gel de alginato. Por ltimo averiguou-se o efeito do

    dimetro das esferas nos parametros cinticos e nas limitaes difusionais internas.

  • [INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

    3

    Introduo

    A Biotecnologia atualmente considerada uma alternativa til aos processos

    tecnolgicos convencionais nos campos analtico e industrial. Isto porque, ao contrrio

    da catlise qumica, os sistemas biolgicos tm a vantagem de conseguir converses

    de qumicos complexos sob condies ambientais moderadas com elevada

    especificidade e eficincia. Sistemas biolgicos ajudam a obter uma maior eficincia do

    processo, um aumento da capacidade fabril e aumento da rentabilidade dos produtos.

    Apesar destas vantagens, o uso de enzimas em aplicaes industriais tem sido limitada

    por diversos fatores, principalmente pelo seu custo elevado, estabilidade e

    quantidades reduzidas disponveis.

    Com o desenvolvimento desta rea, fortaleceu-se a ideia de que dentro dos seres

    vivos, existem substncias capazes de catalisar de modo muito especfico

    determinadas reaces qumicas. Uma enzima um catalisador biolgico, que mesmo

    em baixas concentraes aumenta a velocidade da reaco. As enzimas diminuem a

    energia de activao sem afetarem o equilbrio da reaco.

    Alguns microrganismos so capazes de produzir diversas enzimas de interesse

    industrial. Dentro desses microrganismos a levedura Saccharomyces cerevisiae,

    popularmente conhecida como fermento de panificao, produz a enzima invertase. A

    invertase (-fructofuranosidade) uma enzima que catalisa a hidrlise da sacarose em

    acar invertido invertido, isto , numa mistura equimolar dos seus dois monmeros

    constituintes: glicose e frutose (fig 1).

    O seu substrato preferencial a sacarose porm, tambm, pode hidrolisar ramonose e

    estaquiose.

    Figura 1 - Hidrolise da sacarose catalisada pela invertase. A glicose e a frutose

    so acares redutores.

  • [INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

    4

    A invertase est classificada na famlia GH32 de glicosdeos hidrolases, e encontra-se

    presente nos animais, mas tambm em plantas superiores, fungos e bactrias.

    Leveduras (Saccharomyces sp.) produzem diferentes tipos de invertases:

    intracelulares, ligadas parede, e, mais raramente, extracelulares. As enzimas ligadas

    parede apresentam uma grande frao glicdica atravs da qual acredita-se que se

    liguem a mananas da parede celular. A temperatura tima de atuao 55 C para

    solues diludas de sacarose e de 65 C a 70 C para solues com concentrao

    superior a 10%. Solues acima de 20% de sacarose apresentam taxas decrescentes de

    hidrlise em virtude da reduzida disponibilidade de gua no meio reacional.

    Tabela 1 - Algumas das propriedades das invertases da Saccharomyces cerevisiae .

    Fonte: Brenda

    Existem actualmente vrias aplicaes desta enzima, principalmente na indstria

    alimentar, pois a frutose mais doce que a sacarose (cerca de 40%) e no cristaliza to

    facilmente melhorando a textura de doces e gelados.

    Cintica Enzimtica

    A cintica enzimtica estuda a aco das enzimas, a sua actividade cataltica e seu

    estudo feito in vitro. Para esses estudos podem ser usados, como fonte de enzima,

    preparaes que a contenham em estado mais ou menos purificado, no entanto,

    quanto mais purificada estiver a preparao enzimtica mais fcil ser o seu estudo

    cintico.

    Enzima Livre Enzima Imobilizada

    Km [mM] 41.2 7.43

    pH timo 4.6 4.6

    Temperatura C 45 65

  • [INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

    5

    K1

    K2

    K3

    Foram Leonor Michaelis e Maud Menten, quem primeiro estudou estas relaes,

    apresentando em 1913 um estudo quantitativo das variaes da velocidade de uma

    reao de acordo com o aumento da concentrao de substrato na mesma (Fig.2).

    Figura 2 Grfico que relaciona a velocidade da reao coma a concentrao de

    substrato

    Assim, atravs da equao:

    Em que E a enzima, S o substrato e E-S o complexo enzima-substrato.

    Do estudo desta reaco surge a constante de Michaelis:

    [[ ][ ]

    [ ]]

    Em que uma constante de equilbrio para a dissociao do complexo E-S, onde [E] a

    concentrao de enzima livre, [S] a concentrao de substrato e [E-S] a concentrao

    de enzima que se ligou ao substrato. Substituindo na expresso de

    [ ] [ ] [ ]

    ,fica:

    [ ] [ ] [ ]

    [ ]

    [ ][ ]

    [ ] [ ]

    [ ]

    [ ]

    [ ]

    [ ]

    [ ]

    [ ]

    [ ]

    [ ]

  • [INVERTASE CINTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

    6

    A velocidade da reaco directamente proporcional concentrao de enzima

    ligada, significava que v=k [E- S] e Vmx= k [E0] (E0 a concentrao total de enzima

    ligada ao substrato, e velocidade mxima corresponde a do momento em que todas as

    enzimas esto ligadas ao substrato) e, portanto,

    [ ]

    [ ] , que substituindo na expresso de Km fica

    [ ]

    [ [ ]

    Esta equao, denominada Equao de Michaelis Menten permite no s obter o valor

    de Vmax como tambm de Km (valores estes compreendidos entre 10-8 M e 10-2 M).

    Esta constante permite medir a afinidade da enzima para o substrato, que igual a

    1/Km, ou seja, se a afinidade for elevada Km baixo, sendo necessria uma baixa

    concentrao de substrato para se atingir a velocidade mxima.

    Mais uma vez, obtendo um grfico que relacione a velocidade da reaco com a

    concentrao de substrato, deduz-se que:

    , entao [ ]

    Por outras palavras Km igual concentrao de substrato para qual a velocidade

    igual a metade da velocidade mxima.

    Influncia da temperatura e do pH na actividade enzi