RZ Seminarka BVFP

  • Published on
    23-Aug-2014

  • View
    64

  • Download
    2

Embed Size (px)

Transcript

BIOTECHNOLOGIE VE VROB ERGOCORNINU

Bc. Radka Zajcov

Obsah1 2 3 4 5 vod historick pohled na danou technologii ................................................................. 3 Biologick aktivita produktu............................................................................................... 4 Princip technologickho procesu ........................................................................................ 5 Charakteristika biotechnologickho initele ....................................................................... 5 Mechanismy a regulace vzniku produktu ........................................................................... 7 5.1 5.2 6 Biosyntza ergocorninu ............................................................................................... 7 Regulace vzniku produktu ........................................................................................... 9

Popis technologie a technologickho zazen .................................................................. 10 6.1 6.2 Submerzn kultivace .................................................................................................. 10 Povrchov (stacionrn) kultivace ............................................................................. 13

7 8 9 10

Izolace a purifikace konenho prepartu......................................................................... 14 Aplikace prepartu ............................................................................................................ 15 Ekonomick aspekty procesu ............................................................................................ 16 Seznam pouit literatury .............................................................................................. 17

1 vod historick pohled na danou technologiiNmelov alkaloidy, mezi kter ergocornin pat, jsou pirozenmi sekundrnmi metabolity parazitick houby palikovice nachov (Claviceps purpurea), kter nejastji napad ito a jednodlon trvy (1). U z pirozenho vskytu nmelovch alkaloid plyne prvn pouvan zpsob zskvn tchto slouenin. Jedn se o parazitickou produkci skleroci na umle infikovanm it. Tento zpsob produkce se v nkterch ppadech pouv dodnes, ale m znan omezen. Pro tento typ produkce byly vypstovny modifikovan kmeny pedevm Claviceps purpurea ale i jinch mikroorganism (1). Jeliko parasitick produkce je vzna na ron obdob, cena byla stle relativn vysok a spoteba vzrstala, byla snaha vytvoit kmeny vhodn pro saprofytickou produkci na umlch kultivanch mdich. Problm byl ale v neznalosti biosyntzy alkaloid, co vedlo k nespchu pi pokusu o saprofytickou produkci alkaloid (2, 3). Byly pipraveny kmeny pro povrchovou kultivaci, ale produkce touto cestou nebyla zavedena, protoe bu byl obsah alkaloid velmi mal, nebo zazen pro povrchovou kultivaci znan sloit. Proto byla v padestch letech minulho stolet vyvinuta technologie submerzn kultivace v aerovanch, promchvanch bioreaktorech, kter ale skt mnoh skal (4). V sedmdestch letech Kybal a Vlek vyvinuli relativn jednoduch zazen pro povrchovou (stacionrn) kultivaci, kter ale byla do praxe uvedena jen v ppad produkce alkaloid ergotoxinov skupiny (2). Technologie Parazitick produkce Pozitiva Propracovanj technologie nkdy jedin mon Stle nejastj zpsob produkce Celoron provoz Lep kontrola podmnek pro produkci alkaloid ne u parazitickho zpsobu Negativa Vzanost na ron obdob a podneb Bezpenost ohledn en nmele

Saprofytick submerzn produkce

Saprofytick stacionrn produkce

Nzk poizovac a provozn nklady Celoron provoz

Vysok poizovac a provozn nklady Pouvn protipnivch psad (sniuj produkci) Vysok nroky na udren sterility asto ni obsah alkaloid ne u parazitick produkce Nestabilita produknch kmen Mon odlinosti v jednotlivch kultivanch vacch (kad vak je samostatn reaktor)

Tabulka 1: Klady a zpory pouvanch technologi

3

2 Biologick aktivita produktuErgocornin (Obrzek 1) pat do ergotoxinov skupiny peptidickch nmelovch alkaloid. Na organismus psob stejn jako ostatn nmelov alkaloidy dky podobnosti sv struktury s pirozenmi neurotransmitery serotoninem, dopaminem a noradrenalinem (Obrzek 2).

Obrzek 1: Struktura ergocorninu

Obrzek 2: Srovnn struktury ergolinu a pirozench neurotransmiter (1) Pesn mechanismus inku nebyl dosud objasnn dky obrovsk diverzit

noradrenalinovch, dopaminovch a serotoninovch receptor a schopnosti alkaloid psobit na receptory jak agonisticky tak antagonisticky (2). Vtinou bv pouvn ve sv hydrogenovan form, protoe ta je mn toxick ne nehydrogenovan. Byly popsny inky dihydroergocorninu na prtok krve perifernmi oblastmi a hypertenzi. Prtok krve periferiemi po podn dihydrergocorninu stoup, zatmco tlak u hypertonik kles. Oba inky jsou dny dilatac cv (5).

4

U smsi mesylt hydrogenovanch ergotoxin byly popsny dal pozitivn inky. Dihydroergotoxin mesylt posiluje inek tricyklickch antidepresiv (p. Nortryptilin), co umouje pouit tchto antidepresiv i u tzv. geriatrick deprese, kter bv asto spojena s njakou formou staeck demence. Projevuje se zde tedy dal inek dihydroergotoxinu a to, e pzniv ovlivuje prbh staeckch demenc (6). V mozku dochz ke stimulaci syntzy protein centrlnho nervovho systmu a inhibici adenylcyklzy stimulovan katecholaminy (7).

3 Princip technologickho procesuPro produkci ergocorninu byly vypracovny dv technologie submerzn a povrchov. Oba technologick procesy zanaj zpracovnm produknho kmene zskanho z nkterho depozitu, kde jsou tyto kmeny uchovvny tak, aby byly zachovny jejich vlastnosti. Vsledkem zpracovn pvodnho materilu je inokulum, kter je vhodn pro dal rst. Inokulem jsou okovna mdia v Erlenmeyerovch nebo podobnch bakch, kter jsou pak po uritou dobu inkubovna na tepakch. Tento proces me probhnout v jednom i nkolika stupnch a nsledn jsou pomnoen mycelia pevedena do laboratornch bioreaktor, kde pokrauje proces zvtovn mtka a k produknm reaktorm nebo jen k zskn dostatenho mnostv inokula pro povrchovou kultivaci v igelitovch vacch. dan produkt se vtinou vyskytuje jak v myceliu, tak v kultivanm mdiu. Je tedy nutn zpracovat oboj. Pro izolaci ergocorninu se pouv v obou ppadech ada extrakc pomoc bnch rozpoutdel a produkt je zskn vtinou jako adukt s poslednm rozpoutdlem, ppadn je ergocornin v njak form jet podroben hydrogenaci na dihydroergocornin.

4 Charakteristika biotechnologickho initeleBylo popsno nkolik destek fyziologicky izolovanch i geneticky modifikovanch kmen, kter produkuj ergocornin vtinou ve smsi a dalmi alkaloidy. Absolutn vtina z nich je modifikac Claviceps purpurea (2). Ne vechny popsan kmeny se hod pro prmyslovou kultivaci a produkci ergocorninu. V nsledujcm pehledu je uvedeno nkolik kmen, u kterch byly popsny technologie. Kmen OKI No. 88/1972 (8) byl vylechtn ze skleroci Claviceps purpurea s vysokm obsahem alkaloid bez pouit mutagennch technik ve tech inokulanch krocch5

v opakujcch se cyklech. Pi pouit vtho mnostv fosforu, je pro pechod do produkn fze nutn pdavek chloridu sodnho do mdia. Pdavek 0,1 1% dusinanu amonnho podpo rst mikroorganism a produkci alkaloid. Nejvyho obsahu alkaloid je v kultue dosaeno 6. a 7. den kultivace, kdy obsah alkaloid vztaen k mnostv biomasy je okolo 30 mg/g. Sloen alkaloid produkovanch tmto kmenem je uvedeno v nsledujc Tabulce 2. Tento kmen je uloen v Nrodnm stavu pro veejn zdrav (Orszagos Kozegeszsegugyi Intezet) v Budapeti v Maarsku.Ergokryptinin Ergoconinin 5% 4%

Ergokryptin ErgocorninErgosin Ergometrinin

30% 28%5% 4%

ErgometrinOstatn ve vod rozpustn alkaloidy

22%4%

Tabulka 2: Sloen alkaloid produkovan kmenem OKI No. 88/1972 (8) Kmen MNG 00186 (9) byl stejn jako OKI No.88/1972 vylechtn v Maarsku. Jako zkladn materil byla pouita sklerocia Claviceps purpurea sebran z pirozen infikovanho ita. MNG 00186 byl vsledkem opakovan selekce a obohacovn kmene produkujcch alkaloidy. Selekce probhala na zklad toho, e kolonie produkujc alkaloidy jsou na specifickm mdiu fialov na rozdl od ostatnch blch. Rst tohoto kmene je pomalej ne u bn se vyskytujc kultury palikovice a netvo konidie. Kmen produkuje sms alkaloid, z n 55-60% tvo ergocornin, 25-30% -ergokryptin, a malou st tvo -ergokryptin. Kmen je uloen v Maarsk nrodn sbrce kmen. Kmen IMET PA 130 (9) byl pipraven mutac a na mdich obsahujcch organick nebo anorganick zdroje dusku, cukr, organick kyseliny a bn anorganick soli schopn produkovat alkaloidy ergotoxinov skupiny a ergometrin. Tento kmen je uloen v Centrlnm institutu pro mikrobiologii a experimentln terapii v Jen v Nmecku. CCM F-725 (10) byl vytvoen mutacemi z kmene CCM F-508, kter byl neekonomick z dvodu malho mnostv alkaloid a patnho pomru mezi a -ergokryptinem. CCM F508 byl postupn vystaven inku t mutagen. Prvnm byla kyselina dusin o koncentraci 0,0030 0,0045M, dalm ethylmethansulfont o koncentraci 0,01M a poslednm byl 5-bromuracil ve smsi se sulfathiazolem v pomru 4:1. Tento kmen produkuje sms

6

ergocorninu, -ergokryptinu a -ergokryptinu v pomru 6:5:1 a je uloen v eskoslovensk sbrce mikroorganism J. E. Purkyn v Brn.

5 Mechanismy a regulace vzniku produktu5.1 Biosyntza ergocorninuPi biosyntze peptidickch nmelovch alkaloid samostatn vznikaj ergolinov a peptidick skelet, kter jsou nsledn spojeny multienzymovm komplexem. Biosyntza kyseliny lysergov je znzornna na Obrzku 3.

Obrzek 3: Schma biosyntzy ergolinovho skeletu u rodu Claviceps (2)

7

Cyklick skelet tvoen temi aminokyselinami vznik v multienzymovm komplexu d-lysergyl peptidov syntetzy (LPS), kter je tvoena dvma podjednotkami. Aminokyseliny ani kyselina lyserogov nemohou bt do etzce inkorporovny voln. Proto mus bt aktivovny vazbou pes sirn mstek na protein. V LPS1 podjednotce jsou aktivn msta pro zabudovn aminokyselin do pozice I nebo II (viz. Obrzek 4). dn z aminokyselin nevykazuje vjimenou afinitu k aktivnmu mstu, kter slou k zabudovn aminokyseliny do pozice I. Proto o sloen vslednho ergopeptinu rozhoduje pouze sloen