RZ Seminarka BVFP

  • Published on
    23-Aug-2014

  • View
    64

  • Download
    2

Embed Size (px)

Transcript

<p>BIOTECHNOLOGIE VE VROB ERGOCORNINU</p> <p>Bc. Radka Zajcov</p> <p>Obsah1 2 3 4 5 vod historick pohled na danou technologii ................................................................. 3 Biologick aktivita produktu............................................................................................... 4 Princip technologickho procesu ........................................................................................ 5 Charakteristika biotechnologickho initele ....................................................................... 5 Mechanismy a regulace vzniku produktu ........................................................................... 7 5.1 5.2 6 Biosyntza ergocorninu ............................................................................................... 7 Regulace vzniku produktu ........................................................................................... 9</p> <p>Popis technologie a technologickho zazen .................................................................. 10 6.1 6.2 Submerzn kultivace .................................................................................................. 10 Povrchov (stacionrn) kultivace ............................................................................. 13</p> <p>7 8 9 10</p> <p>Izolace a purifikace konenho prepartu......................................................................... 14 Aplikace prepartu ............................................................................................................ 15 Ekonomick aspekty procesu ............................................................................................ 16 Seznam pouit literatury .............................................................................................. 17</p> <p>1 vod historick pohled na danou technologiiNmelov alkaloidy, mezi kter ergocornin pat, jsou pirozenmi sekundrnmi metabolity parazitick houby palikovice nachov (Claviceps purpurea), kter nejastji napad ito a jednodlon trvy (1). U z pirozenho vskytu nmelovch alkaloid plyne prvn pouvan zpsob zskvn tchto slouenin. Jedn se o parazitickou produkci skleroci na umle infikovanm it. Tento zpsob produkce se v nkterch ppadech pouv dodnes, ale m znan omezen. Pro tento typ produkce byly vypstovny modifikovan kmeny pedevm Claviceps purpurea ale i jinch mikroorganism (1). Jeliko parasitick produkce je vzna na ron obdob, cena byla stle relativn vysok a spoteba vzrstala, byla snaha vytvoit kmeny vhodn pro saprofytickou produkci na umlch kultivanch mdich. Problm byl ale v neznalosti biosyntzy alkaloid, co vedlo k nespchu pi pokusu o saprofytickou produkci alkaloid (2, 3). Byly pipraveny kmeny pro povrchovou kultivaci, ale produkce touto cestou nebyla zavedena, protoe bu byl obsah alkaloid velmi mal, nebo zazen pro povrchovou kultivaci znan sloit. Proto byla v padestch letech minulho stolet vyvinuta technologie submerzn kultivace v aerovanch, promchvanch bioreaktorech, kter ale skt mnoh skal (4). V sedmdestch letech Kybal a Vlek vyvinuli relativn jednoduch zazen pro povrchovou (stacionrn) kultivaci, kter ale byla do praxe uvedena jen v ppad produkce alkaloid ergotoxinov skupiny (2). Technologie Parazitick produkce Pozitiva Propracovanj technologie nkdy jedin mon Stle nejastj zpsob produkce Celoron provoz Lep kontrola podmnek pro produkci alkaloid ne u parazitickho zpsobu Negativa Vzanost na ron obdob a podneb Bezpenost ohledn en nmele</p> <p>Saprofytick submerzn produkce</p> <p>Saprofytick stacionrn produkce</p> <p>Nzk poizovac a provozn nklady Celoron provoz</p> <p>Vysok poizovac a provozn nklady Pouvn protipnivch psad (sniuj produkci) Vysok nroky na udren sterility asto ni obsah alkaloid ne u parazitick produkce Nestabilita produknch kmen Mon odlinosti v jednotlivch kultivanch vacch (kad vak je samostatn reaktor)</p> <p>Tabulka 1: Klady a zpory pouvanch technologi</p> <p>3</p> <p>2 Biologick aktivita produktuErgocornin (Obrzek 1) pat do ergotoxinov skupiny peptidickch nmelovch alkaloid. Na organismus psob stejn jako ostatn nmelov alkaloidy dky podobnosti sv struktury s pirozenmi neurotransmitery serotoninem, dopaminem a noradrenalinem (Obrzek 2).</p> <p>Obrzek 1: Struktura ergocorninu</p> <p>Obrzek 2: Srovnn struktury ergolinu a pirozench neurotransmiter (1) Pesn mechanismus inku nebyl dosud objasnn dky obrovsk diverzit</p> <p>noradrenalinovch, dopaminovch a serotoninovch receptor a schopnosti alkaloid psobit na receptory jak agonisticky tak antagonisticky (2). Vtinou bv pouvn ve sv hydrogenovan form, protoe ta je mn toxick ne nehydrogenovan. Byly popsny inky dihydroergocorninu na prtok krve perifernmi oblastmi a hypertenzi. Prtok krve periferiemi po podn dihydrergocorninu stoup, zatmco tlak u hypertonik kles. Oba inky jsou dny dilatac cv (5).</p> <p>4</p> <p>U smsi mesylt hydrogenovanch ergotoxin byly popsny dal pozitivn inky. Dihydroergotoxin mesylt posiluje inek tricyklickch antidepresiv (p. Nortryptilin), co umouje pouit tchto antidepresiv i u tzv. geriatrick deprese, kter bv asto spojena s njakou formou staeck demence. Projevuje se zde tedy dal inek dihydroergotoxinu a to, e pzniv ovlivuje prbh staeckch demenc (6). V mozku dochz ke stimulaci syntzy protein centrlnho nervovho systmu a inhibici adenylcyklzy stimulovan katecholaminy (7).</p> <p>3 Princip technologickho procesuPro produkci ergocorninu byly vypracovny dv technologie submerzn a povrchov. Oba technologick procesy zanaj zpracovnm produknho kmene zskanho z nkterho depozitu, kde jsou tyto kmeny uchovvny tak, aby byly zachovny jejich vlastnosti. Vsledkem zpracovn pvodnho materilu je inokulum, kter je vhodn pro dal rst. Inokulem jsou okovna mdia v Erlenmeyerovch nebo podobnch bakch, kter jsou pak po uritou dobu inkubovna na tepakch. Tento proces me probhnout v jednom i nkolika stupnch a nsledn jsou pomnoen mycelia pevedena do laboratornch bioreaktor, kde pokrauje proces zvtovn mtka a k produknm reaktorm nebo jen k zskn dostatenho mnostv inokula pro povrchovou kultivaci v igelitovch vacch. dan produkt se vtinou vyskytuje jak v myceliu, tak v kultivanm mdiu. Je tedy nutn zpracovat oboj. Pro izolaci ergocorninu se pouv v obou ppadech ada extrakc pomoc bnch rozpoutdel a produkt je zskn vtinou jako adukt s poslednm rozpoutdlem, ppadn je ergocornin v njak form jet podroben hydrogenaci na dihydroergocornin.</p> <p>4 Charakteristika biotechnologickho initeleBylo popsno nkolik destek fyziologicky izolovanch i geneticky modifikovanch kmen, kter produkuj ergocornin vtinou ve smsi a dalmi alkaloidy. Absolutn vtina z nich je modifikac Claviceps purpurea (2). Ne vechny popsan kmeny se hod pro prmyslovou kultivaci a produkci ergocorninu. V nsledujcm pehledu je uvedeno nkolik kmen, u kterch byly popsny technologie. Kmen OKI No. 88/1972 (8) byl vylechtn ze skleroci Claviceps purpurea s vysokm obsahem alkaloid bez pouit mutagennch technik ve tech inokulanch krocch5</p> <p>v opakujcch se cyklech. Pi pouit vtho mnostv fosforu, je pro pechod do produkn fze nutn pdavek chloridu sodnho do mdia. Pdavek 0,1 1% dusinanu amonnho podpo rst mikroorganism a produkci alkaloid. Nejvyho obsahu alkaloid je v kultue dosaeno 6. a 7. den kultivace, kdy obsah alkaloid vztaen k mnostv biomasy je okolo 30 mg/g. Sloen alkaloid produkovanch tmto kmenem je uvedeno v nsledujc Tabulce 2. Tento kmen je uloen v Nrodnm stavu pro veejn zdrav (Orszagos Kozegeszsegugyi Intezet) v Budapeti v Maarsku.Ergokryptinin Ergoconinin 5% 4%</p> <p>Ergokryptin ErgocorninErgosin Ergometrinin</p> <p>30% 28%5% 4%</p> <p>ErgometrinOstatn ve vod rozpustn alkaloidy</p> <p>22%4%</p> <p>Tabulka 2: Sloen alkaloid produkovan kmenem OKI No. 88/1972 (8) Kmen MNG 00186 (9) byl stejn jako OKI No.88/1972 vylechtn v Maarsku. Jako zkladn materil byla pouita sklerocia Claviceps purpurea sebran z pirozen infikovanho ita. MNG 00186 byl vsledkem opakovan selekce a obohacovn kmene produkujcch alkaloidy. Selekce probhala na zklad toho, e kolonie produkujc alkaloidy jsou na specifickm mdiu fialov na rozdl od ostatnch blch. Rst tohoto kmene je pomalej ne u bn se vyskytujc kultury palikovice a netvo konidie. Kmen produkuje sms alkaloid, z n 55-60% tvo ergocornin, 25-30% -ergokryptin, a malou st tvo -ergokryptin. Kmen je uloen v Maarsk nrodn sbrce kmen. Kmen IMET PA 130 (9) byl pipraven mutac a na mdich obsahujcch organick nebo anorganick zdroje dusku, cukr, organick kyseliny a bn anorganick soli schopn produkovat alkaloidy ergotoxinov skupiny a ergometrin. Tento kmen je uloen v Centrlnm institutu pro mikrobiologii a experimentln terapii v Jen v Nmecku. CCM F-725 (10) byl vytvoen mutacemi z kmene CCM F-508, kter byl neekonomick z dvodu malho mnostv alkaloid a patnho pomru mezi a -ergokryptinem. CCM F508 byl postupn vystaven inku t mutagen. Prvnm byla kyselina dusin o koncentraci 0,0030 0,0045M, dalm ethylmethansulfont o koncentraci 0,01M a poslednm byl 5-bromuracil ve smsi se sulfathiazolem v pomru 4:1. Tento kmen produkuje sms</p> <p>6</p> <p>ergocorninu, -ergokryptinu a -ergokryptinu v pomru 6:5:1 a je uloen v eskoslovensk sbrce mikroorganism J. E. Purkyn v Brn.</p> <p>5 Mechanismy a regulace vzniku produktu5.1 Biosyntza ergocorninuPi biosyntze peptidickch nmelovch alkaloid samostatn vznikaj ergolinov a peptidick skelet, kter jsou nsledn spojeny multienzymovm komplexem. Biosyntza kyseliny lysergov je znzornna na Obrzku 3.</p> <p>Obrzek 3: Schma biosyntzy ergolinovho skeletu u rodu Claviceps (2)</p> <p>7</p> <p>Cyklick skelet tvoen temi aminokyselinami vznik v multienzymovm komplexu d-lysergyl peptidov syntetzy (LPS), kter je tvoena dvma podjednotkami. Aminokyseliny ani kyselina lyserogov nemohou bt do etzce inkorporovny voln. Proto mus bt aktivovny vazbou pes sirn mstek na protein. V LPS1 podjednotce jsou aktivn msta pro zabudovn aminokyselin do pozice I nebo II (viz. Obrzek 4). dn z aminokyselin nevykazuje vjimenou afinitu k aktivnmu mstu, kter slou k zabudovn aminokyseliny do pozice I. Proto o sloen vslednho ergopeptinu rozhoduje pouze sloen prosted, ve kterm se organismus nachz. Toho se d vyut v zen kultivanho procesu. Naopak aktivn msto k zabudovn aminokyseliny do pozice dv znan upednostuje L-fenylalanin. Do pozice III je u rodu Claviceps vdy inkorporovn L-prolin. (2)</p> <p>Obrzek 4: Substrty inkorporovan do d-lysergylpeptidlaktmu d-lysergylpeptid syntetzou a jejich relativn afinity. (2) Podjednodka LPS2 aktivuje kyselinu lysergovou a zan tak syntzu cyklickho tripeptidu. Na nsledujcm obrzku (Obrzek 5) je znzornno schma funkce LPS pi biosyntze ergotaminu. Pro syntzu ergocorninu, pak sta eliminovat L-fenylalanin z prosted a nahradit jej valinem.</p> <p>8</p> <p>Takto vytvoen laktm je nsledn oxidovn pomoc oxygenz m vznik hydroxylov skupina a posledn oteven kruh v peptidick sti se samovoln uzave. (2)</p> <p>Obrzek 5: Schma syntetickch krok katalyzovanch LPS. Lev horn roh kadho diagramu znzoruje aktivn msto LPS2, ostatn pak aktivn msta LPS1.(2)</p> <p>5.2 Regulace vzniku produktuPrimrn metabolismus je vdy zce specifikovan, protoe jakkoli chyba ve stavebnch kamenech organismu by mohla mt fatln dsledky. Zato sekundrn metabolity, kter nemaj pmou souvislost se ivotaschopnost organismu, maj znan volnj regulaci, a proto konenm vsledkem bv asto sms rznch slouenin. Stejn tak je to i u divokch kmen Claviceps. V ppad, e danm produktem je pouze nkolik vybranch slouenin, je nutn zsah do syntetickho systmu mikroorganismu a regulace vzniku produktu pomoc sloen kultivanho mdia (1).9</p> <p>Z uhlkatch zdroj je nutn pouvat sloitj cukry, kter jsou mikroorganismem he metabolizovny, protoe syntza alkaloid bu v rstov fzi neprobh, nebo jen v minimln me. Pout jako substrt glukzu nen vhodn z dvodu katabolick represe. Pro dobr vyuit sacharzy je nutn do kultivanho mdia pidat sekundrn zdroj uhlku napklad nkter intermedit citrtovho nebo glyoxaltovho cyklu (2). Pro vtinu sekundrnch produkt je mal obsah anorganickho fosforu v mdiu stimulujcm prvkem. Fosfor je bhem prvnch dn kultivace akumulovn v myceliu, kde zastavuje rst a nastartuje produkci alkaloid. Naopak vy obsah fosforu me vyvolat degradaci vzniklch alkaloid (2). V mdiu mus bt tak ptomen vhodn zdroj dusku. Tento prvek je dleit jak pro rst, tak pro syntzu alkaloid. Problmem me bt nalezen vhodnho zdroje pro oba dva procesy (2). Dle je syntzu produktu mon ovlivnit pdavkem prekurzor do mdia, pH, teplotou a mnostvm kyslku v reaktoru. V ppad ergocorninu je mon do kultivanho mdia pidvat mal mnostv valinu (9).</p> <p>6 Popis technologie a technologickho zazen6.1 Submerzn kultivaceSubmerzn produkce ergocorninu je podstatn bnj ne stacionrn kultivace a proto je popsno nkolik technologi, kter maj mnoho spolench rys. Technologie popsan Wackem a dalmi (8) pouv produkn kmen OKI No. 88/1972 popsan ve. Tento kmen je po 30 dn kultivovn na pevnm kultivanm mdiu SB 010 o sloen popsanm v Tabulce 3. Vznikne souvisl vrstva mycelia, kter je po oddlen z agarovho povrchu suspendovna a homogenizovna ve vod. Do 750ml Erlenmeyerovch bank, kter obsahuj po 200 ml SC 100 mdia, je pidno po 20 ml suspenze zskan v pedchozm kroku a baky jsou 6 dn protepvny pi teplot 24C. est den jsou baky po dvou pouity jako inokulum pro ti 10l bioreaktory, z nich kad je naplnn 6l sterilnho SB 101 mdia. V tchto reaktorech probh dalch pt dn kultivace pi 25C s rychlost aerace 0,5l vzduchu/l.min a mchnm 240 ot./min . Na konci tohoto obdob je obsah vech t reaktor spojen (18l) a pouit jako inokulum pro produkn prmyslov reaktor o objemu 300l, kter obsahuje 200l sterilnho SC 101 kapalnho mdia. Reaktor je mchn rychlost10</p> <p>300 ot/min a provzduovn rychlost 9m3 vzduchu za hodinu. Kultivace probh est dn pi teplot 25C, piem mezi 55 a 60 hodinou kultivace je pH udrovno na hodnot 4,5 pomoc pdavku hydroxidu amonnho. Po ukonen kultivace je obsah alkaloid 1246 mg/L, z eho 646 mg/L tvo sms ergocorninu a ergokryptinu. SB 010Sacharza Kyselina jantarov Dusinan amonn Dusinan vpenat Dihydrofosforenan draseln Sran hoenat Hydroxid amonn Vlknit agar voda 100,0g 10,0g 10,0g 1,0g 0,25g 0,25g do pH 5,2 25,0g zbytek do 1000ml</p> <p>SC 100Sacharza Kyselina citronov Sran hoenat Dihydrofosforenan draseln Chlorid sodn Hydroxid amonn voda 100,0g 10,0g 0,3g 0,5g 10,0g do pH 5,2 zbytek do 1000ml</p> <p>SB 101Sacharza Kyselina jantarov Dusinan amonn Dusinan vpenat Dihydrofosforenan draseln Sran hoenat Chlorid sodn Hydroxid amonn voda 100,0g 10,0g 1,0g 1,0g 0,5g 0,3g 10,0g do pH 5,2 zbytek do 1000ml</p> <p>SC 101 (l)Sacharza Kyselina citronov Chlorid sodn Dusinan amonn Dihydrofosforenan draseln Sran hoenat Hydroxid amonn Voda 100,0g 10,0g 10,0g 1,0g 0,3g do pH 5,2 zbytek do 1000ml</p> <p>Tabulka 3: Sloen kultivanch mdi I.</p> <p>Dal technologie byla popsna Wackem et al. v roce 1983 (9) a pro produkci ergocorninu pouv jin produkn kmen a to MNG 00186. Pro kultivaci je pouita 25 dn star kultura MNG 00186 rostouc na St agar (Blake) mdiu, kter je sekrbnuta a homogenizovna ve 100ml fyziologickho roztoku. V tlitrov kuelov bace s jednm litrem GK kultivanho mdia je pak tato suspenze pouita jako inokulum. Baka je pak 44 hodin protepvna pi teplot 24C. Pot je obsah baky peveden do 15l laboratornho bioreaktoru, kter obsahuje 10l TC-54 mdia. Kultivace probh pi teplot 24C po ti dny pi mchn 240 ot./min a aeraci 0,25 l/l/min. Vsle...</p>