SOLUTIONS DE RECHANGE AUX ANIMAUX MODIFIÉS PAR GÉNIE GÉNÉTIQUE ?· SOLUTIONS DE RECHANGE AUX ANIMAUX…

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    12-Sep-2018

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<ul><li><p>SOLUTIONS DE RECHANGE AUX ANIMAUX MODIFIS PAR GNIE GNTIQUE </p><p>MARS 2014 </p><p>TABLES DES MATIRES </p><p>PRFACE ................................................................................................................... 2 </p><p>1. Techniques de production danimaux modifis par gnie gntique .......... 2 </p><p>1.1 Injection pronuclaire ................................................................................. 2 </p><p>1.2 Transgense cible et mutagense dans des cellules souches </p><p>embryonnaires ............................................................................................ 4 </p><p> 1.2.1 Transgense cible ........................................................................................... 4 </p><p> 1.2.2 Mutagense cible ............................................................................................. 6 </p><p>1.3 Transfert gnique mdiation virale (transgense par lentivirus) .............. 6 </p><p>1.4 Chromosomes artificiels bactriens (BAC) ................................................. 6 </p><p>1.5 ZFN (nuclases doigts de zinc) et TALEN (acronyme pour Transcription </p><p>Activator-Like Effector Nuclease) ............................................................... 7 </p><p>2. Raffinements pour contrler lexpression du transgne ................................ 7 </p><p>2.1 Technologies de knock-out conditionnel et de transgense (p. ex. les </p><p>systmes de recombinaison FLP/FRT et Cre-loxP) ................................... 7 </p><p>2.2 Isolants ....................................................................................................... 9 </p><p>2.3 Slection du promoteur pour la transgense .............................................. 9 </p><p>2.4 Vecteurs de pigeage ................................................................................ 9 </p><p>3. Raffinements pour le transfert dembryons ................................................... 10 </p><p>3.1 Transfert non chirurgical dembryons (NSET) chez la souris .................... 10 </p><p>3.2 Transfert gnique par des spermatozodes .............................................. 10 </p><p>RFRENCES .......................................................................................................... 11 </p></li><li><p>SOLUTIONS DE RECHANGE AUX ANIMAUX MODIFIS PAR GNIE GNTIQUE 2014 </p><p>2 </p><p>PRFACE1 </p><p>La mthode utilise pour la production d'une ligne d'animaux modifis par gnie gntique </p><p>dpendra essentiellement du type de modification gntique ncessaire. Nanmoins, il faut </p><p>galement tenir compte, lors du choix de la mthode, des questions de bien-tre et des </p><p>possibilits de raffinement pour nuire le moins possible au bien-tre des animaux et amliorer </p><p>l'efficacit de la production. La production dun animal modifi par gnie gntique doit tre </p><p>prcde dune confirmation que la ligne nest pas disponible ailleurs, car la rptition inutile </p><p>de toute production est un gaspillage d'animaux. </p><p>La section 1 de ce document propose un panorama des mthodes employes pour produire des </p><p>animaux modifis par gnie gntique. Chaque mthode succinctement dcrite est accompagne </p><p>des proccupations pour le bien-tre animal souleves ainsi que des possibilits de raffinement </p><p>afin de rduire le nombre danimaux requis ou damliorer le bien-tre des animaux utiliss. Les </p><p>solutions proposes sont compltes par une discussion sur dautres mthodes ou des </p><p>amliorations de celles en usage, en dgagent le raffinement du contrle de lexpression gnique </p><p>(section 2) et des techniques de reproduction (section 3). Pour de l'information sur les mthodes </p><p>d'identification, les pratiques exemplaires actuelles pour l'obtention de matriel gntique et les </p><p>possibilits de raffinements pour le gnotypage, consulter Solutions de rechange pour le </p><p>gnotypage des animaux modifis par gnie gntique (en prparation). </p><p>1. Techniques de production danimaux modifis par gnie gntique </p><p>1.1 Injection pronuclaire </p><p>Linjection pronuclaire est utilise pour produire des animaux qui expriment les squences de </p><p>gnes sous le contrle d'un promoteur htrologue. Le promoteur et les squences de gnes </p><p>peuvent provenir dune mme espce ou d'espces diffrentes. Il sagit dune technique courante </p><p>dans les tudes sur les effets dune surexpression ou dune mauvaise expression de certaines </p><p>squences gntiques. Toutefois, les transgnes qui expriment des constructions dites ngatives </p><p>(Levin et coll., 1993, Inoue et coll., 2010) ou les ARN interfrents (petit ARNi, microARN, </p><p>ARNi) (Casola, 2010) peuvent tre utiliss pour produire des knock-out chez les organismes ne </p><p>pouvant faire lobjet dune mutagense cible, comme solution de rechange cette approche </p><p>pour affecter le fonctionnement des complexes multiprotiques ou comme technique de </p><p>mutagense conditionnelle lorsque combin des recombinaisons diriges ou autres </p><p>technologies. </p><p>Proccupations pour le bien-tre animal </p><p> Comme les transgnes sintgrent de faon alatoire dans le chromosome, leur expression peut varier en fonction du site d'insertion (effet de position) ou provoquer une mutagense </p><p>insertionnelle lors dune insertion dans des gnes natifs. Cela peut affecter la survie des </p><p>embryons injects ou avoir des effets imprvus sur le bien-tre des animaux produits </p><p>(Robinson et coll., 2003; Kirkwood et Hubrecht, 2010). </p><p> 1 Ce document de meilleures pratiques a t rdig par un comit, dirig par le CCPA, qui a particip llaboration </p><p>des lignes directrices sur les animaux modifis par gnie gntique. </p></li><li><p>SOLUTIONS DE RECHANGE AUX ANIMAUX MODIFIS PAR GNIE GNTIQUE 2014 </p><p>3 </p><p> De multiples lignes fondatrices sont ncessaires pour un contrle efficace des effets de position et de mutagense insertionnelle, ce qui augmente le nombre d'animaux ncessaires </p><p>(notamment pour la comparaison de plusieurs promoteurs ou de squences exprimes). </p><p> Certains sites d'intgration peuvent entraner l'chec de l'expression ou de la transmission ultrieure du transgne, ce qui signifie que les animaux utiliss ont t gaspills (Robinson et </p><p>coll., 2003). </p><p> Pour produire relativement peu d'animaux possdant les niveaux et les profils d'expression dsirs du transgne, il faut un assez grand nombre dembryons (Robinson et coll., 2003). </p><p> Un grand nombre de donneuses et de receveuses dembryons peut tre ncessaire (Robinson et coll., 2003). </p><p>Considrations exprimentales </p><p> Le taux de succs varie d'un animal l'autre. Cette mthode est actuellement inefficace chez les mdakas, les xnopus et les poulets, o l'ADN tranger ne peut gnralement pas </p><p>s'intgrer dans le gnome de lanimal (Houdebine, 2002). </p><p> L'expression transgnique peut steindre aprs plusieurs gnrations en raison dun silenage pigntique du promoteur du transgne. </p><p>Possibilits de raffinement </p><p>Les mthodes suivantes peuvent aider rsoudre les problmes lis l'intgration alatoire du </p><p>transgne : la transgense cible dans des cellules souches embryonnaires (section 1.2), le </p><p>transfert de gnes par mdiation virale (section 1.3), les chromosomes artificiels bactriens </p><p>(BAC) transgniques (section 1.4) et la transgense cible au moyen de nuclases doigts de </p><p>zinc (ZFN) ou de nuclases effectrices de type activateur de transcription (TALEN) (section 1.5), </p><p>ainsi que des possibilits de raffinement comme les procds dexpression transgnique </p><p>inductible et conditionnelle (sections 2.1 et 2.2), l'utilisation d'isolateurs (section 2.3) et la </p><p>slection rigoureuse des promoteurs (section 2.4). </p><p>Dautres techniques peuvent galement traiter de problmes lis au bien-tre des animaux utiliss </p><p>pour la production danimaux modifis par gnie gntique, comme le transfert non chirurgical </p><p>dembryon (NSET) (section 3.1) et le transfert de gnes par des spermatozodes (section 3.2). </p><p>De plus, il convient de tenir compte de certaines variables pouvant tre lies la conception et </p><p>prparation dune construction ainsi que de l'expression et la transmission du transgne lors du </p><p>recours l'injection pronuclaire. Les variables en question sont dcrites par Robinson et coll. </p><p>(2003). </p><p>Pour rduire le risque de perte de lexpression du transgne aprs plusieurs gnrations, des </p><p>sujets de la premire gnration de transgniques devraient tre cryoconservs. Il est alors </p><p>possible de rcuprer la ligne en cas de perte d'expression du transgne, sans devoir la crer de </p><p>nouveau. Toute ligne fondatrice supplmentaire non slectionne pour une utilisation </p><p>exprimentale devrait galement tre cryoconserve; il est inutile de la reproduire sur plusieurs </p><p>gnrations. </p></li><li><p>SOLUTIONS DE RECHANGE AUX ANIMAUX MODIFIS PAR GNIE GNTIQUE 2014 </p><p>4 </p><p>1.2 Transgense cible et mutagense dans des cellules souches embryonnaires </p><p> 1.2.1 Transgense cible </p><p>Le ciblage dsigne l'insertion ou la dltion de squences d'ADN gnomique un endroit prcis. </p><p>Il se pratique le plus souvent par recombinaison homologue dans les cellules souches </p><p>embryonnaires de souris. Cependant, lingnierie par nuclases diriges a permis le ciblage dans </p><p>des cellules souches embryonnaires de souris (Osiak et coll., 2011) et dans les embryons de </p><p>divers animaux, dont les rats, les lapins et les poissons-zbres (Ben et coll., 2011; De Souza, </p><p>2012; Duranthon et coll., 2012; Jacob et coll., 2010) (section 1.5). Les recombinases (p. ex. Cre </p><p>et FLP) et les intgrases (p. ex. PhiC31) site spcifique sont galement utilises pour le ciblage </p><p>dans les cellules souches embryonnaires et les embryons (Lister, 2011; Monetti et coll., 2011; </p><p>Osterwalder et coll., 2010; Tasic et coll., 2011). Ces mthodes permettant une transgense cible, </p><p>c'est--dire une intgration du transgne dans un locus choisi, sont adaptes de la mutagense </p><p>cible (Tchorz et coll., 2012). Comme la transgense cible permet un meilleur contrle de la </p><p>modification gntique que l'injection pronuclaire, elle peut tre utilise pour minimiser les </p><p>effets ngatifs sur le bien-tre des animaux produits (Robinson et coll., 2003). </p><p>Proccupations concernant le bien-tre </p><p> La contamination de cellules souches embryonnaires par des mycoplasmes affecte diffrents paramtres des cellules, la transmission germinale et le dveloppement postnatal des </p><p>chimres cres. Il est donc important, avant dutiliser des cellules souches embryonnaires, </p><p>deffectuer un dpistage des mycoplasmes (Markoullis et coll., 2009). </p><p> Les cultures de cellules souches embryonnaires sont une source possible d'infection pathogne et elles sont susceptibles une infection persistante par le virus de lhpatite </p><p>murine (VHM) ou dautres virus murins (Nicklas et Weiss, 2000). </p><p> L'chec de la transmission germinale peut signifier un gaspillage de souris et une utilisation inutile de femelles pour fournir des embryons-htes et de mres porteuses (Robinson et coll., </p><p>2003). </p><p> La littrature rapporte plusieurs cas de mutagense induite hors cible dans la cellule souche embryonnaire soit par des rarrangements gnomiques, des duplications ou des dltions </p><p>(Liang et coll., 2008), ou encore par des insertions multiples du vecteur. Ce type de </p><p>mutagense peut entraner des problmes de bien-tre involontaires ou imprvus. </p><p>Considrations exprimentales </p><p> Cette procdure dlicate raliser exige des taux constamment levs de transmission de la ligne germinale du gnome des cellules souches embryonnaires, d'excellentes techniques de </p><p>culture cellulaire afin de maintenir la pluripotence des cellules souches embryonnaires et au </p><p>moins deux gnrations de slection pour produire des homozygotes (Robinson et coll., </p><p>2003). </p><p> Une mutation constitutive dltre peut tre mortelle ou le gne peut affecter d'autres voies, ce qui rend difficile l'tude de la physiologie ou du gne d'intrt. </p></li><li><p>SOLUTIONS DE RECHANGE AUX ANIMAUX MODIFIS PAR GNIE GNTIQUE 2014 </p><p>5 </p><p>Possibilits de raffinement </p><p>Le ciblage de gnes dans l'embryon (p. ex. laide de recombinases, de nuclases ou dintgrases </p><p> site spcifique) est un moyen de surmonter les difficults lies la pluripotence rsultant de </p><p>l'utilisation des cellules souches embryonnaires, mais l'efficacit rduite avec laquelle les </p><p>gnomes embryonnaires sont modifis peut ne pas mener la rduction du nombre d'animaux </p><p>utiliss. Pour rduire le nombre danimaux ncessaires la production de lignes danimaux </p><p>vises, le criblage doit tre effectu au moyen de lignes parentales de cellules souches </p><p>embryonnaires possdant un haut taux de succs de transmission germinale. </p><p>Le contrle peut tre optimis par l'utilisation danimaux knock-out conditionnels (section 2.1) et </p><p>de transgnes inductibles (section 2.2) et peut galement limiter les rpercussions sur le bien-tre </p><p>des animaux issus de la biotechnologie. </p><p>Les cellules souches embryonnaires peuvent prsenter des anomalies gnomiques ou </p><p>chromosomiques au cours de leur mise en culture (p. ex. laneuplodie) pouvant rduire leur </p><p>pluripotence et leur taux de transmission de la ligne germinale. Le comptage des chromosomes </p><p>permet de dterminer si les cellules souches embryonnaires sont euplodes ou aneuplodes et peut </p><p>aider la slection des clones les plus susceptibles de contribuer la ligne germinale. Par </p><p>consquent, il convient de procder au comptage avant la microinjection de cellules souches </p><p>embryonnaires. Selon le consensus chez les chercheurs du domaine, la propagation </p><p>chromosomique de rfrence pour produire des chimres correspond au moins 50 % des </p><p>euplodes au cours de la mitose (valuation dau moins 20 transmissions). Cependant, certains </p><p>tablissements ne permettent leur utilisation que lorsquun taux entre 60 % et 70 % est atteint. </p><p>Lorsque tous les clones descendent du mme anctre pour une mutation dirige donne et que les </p><p>normes de plodie ne sont pas atteintes, il est possible de produire des sous-clones euplodes </p><p>isols par sous-clonage. Pour cela, il faut par contre veiller maintenir la pluripotence des </p><p>cellules souches embryonnaires pendant le sous-clonage et un deuxime comptage des </p><p>chromosomes devrait tre effectu pour vrifier le pourcentage de cellules euplodes. </p><p>L'utilisation de cellules souches embryonnaires co-isogniques (des cellules souches </p><p>embryonnaires provenant de la ligne vise par lexprimentation animale) limine le besoin de </p><p>recourir au rtrocroisement pour atteindre le statut congnique. Dans la mesure du possible, le </p><p>ciblage doit tre effectu dans des cellules souches embryonnaires coisogniques. </p><p>Chez la souris, les mthodes de production de chimres partir dembryons htes exogames </p><p>(p. ex. l'agrgation ou la microinjection dun embryon 8 blastomres) peuvent rduire le </p><p>nombre de donneuses d'embryons ncessaires, puisque les femelles exogames produisent des </p><p>embryons plus utilisables que ceux produits par de nombreuses lignes consanguines courantes </p><p>(Gertsenstein et coll., 2010; Kiyonari et coll., 2010; Poueymirou et coll., 2007). Il est galement </p><p>possible daugmenter le nombre d'embryons utilisables en modifiant le nombre de cellules </p><p>souches embryonnaires injectes. </p><p>Les contaminants infectieux peuvent tre un facteur de confusion dans les tudes in vivo. </p><p>Consquemment, le dpistage des agents pathognes est recommand comme pratique </p><p>exemplaire avant la microinjection de cellules souches embryonnaires (Peterson, 2008). </p></li><li><p>SOLUTIONS DE RECHANGE AUX ANIMAUX MODIFIS PAR GNIE GNTIQUE 2014 </p><p>6 </p><p> 1.2.2 Mutagense cible </p><p>La mutagense cible est utilise pour muter un gne spcifique dans des cellules souches </p><p>e...</p></li></ul>

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