Tinción de Gram

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    16-Sep-2015

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Ao de la Diversificacin Productiva y Fortalecimiento de la Educacin

FACULTAD DE INGENIERA, ARQUITECTURA Y URBANISMOESCUELA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL Y COMERCIO EXTERIOR INFORME DE MICROBIOLOGA APLICADA

Aislamiento de Bacterias y diferenciacin mediante la tincin de gram

Docente:

Integrantes: Erika Pamela Sanchez Zapata Lelis Yakeline Bustamante Snchez Marianghella Salazar vsquezTincin de GramINTRODUCCIN De gran importancia en Microbiologa porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten ante esta tincin. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica externa. Tras la tincin con el primer colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol que arrastrar al colorante slo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las clulas permanecern azules. Las clulas Gram (-) se teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.

Objetivos Utilizacin de tcnicas sencillas para la observacin de microorganismos Conocer o manejo del microscopio ptico para la observacin de bacterias (importancia del objetivo de inmersin) Conocer y manejar las unidades de medida de las clulas y establecer comparaciones entre tamaos de procariotas y de eucariotas Reconocer los distintos modelos de pared bacteriana.

Procedimiento experimental: Materiales: Mechero de bunsen o de alcohol Ansa Bacteriolgica Porta objetos Muestras bacterianas previamente cultivadas de diferentes medios: al medio ambiente por 15 minutos, hisopado de manos sin lavarse, hisopado de manos limpias, muestra de un cultivo puro Aceite de inmersin Soporte de Tinciones Goteros Colorantes para Tincin: Solucin de cristal Violeta, Lugol ,Safranina Etanol 95% Agua destilada Microscopio

Grupo 1: Grupo 2: Grupo 3:

Grupo 4:

Procedimiento: Prepare un frotis de cada uno de los microorganismos, Para preparar los frotis se sigue el siguiente procedimiento: Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de agua, que es suficiente. Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Tomar, en condiciones aspticas, una pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Nota: Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensin bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el portaobjetos a la llama del mechero. En este caso hay que tener muchas precauciones de no calentar demasiado el portaobjetos pues las clulas pueden deformarse o romperse. coloque una gota de agua en el portaobjetos, y luego transfiriendo cada organismo separadamente a la gota de agua usando un asa de siembra esterilizada y enfriada

Permita que los frotis se sequen al aire y luego fjelos con calor. Tia con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que acte durante 1 minuto. Lave suavemente con agua. Inunde suavemente con el mordiente, yodo de Gram, y deje actuar durante 1 minuto. Lave suavemente con agua. Decolore con alcohol etlico al 95%. Nota: no sobre decolore, agregue el alcohol gota a gota hasta que este salga casi claro, solo ligeramente azul. Lave suavemente con agua. Agregue la safranina para la tincin de contraste. Lave suavemente con agua Seque la preparacin. Examine al microscopio con el objetivo 100X de inmersin de aceite.

Conclusiones y resultados Observamos y procedimos a aislar la bacteria de los mtodos anteriormente realizados.

Realizamos la tincin de Gram en la bacteria aislada anteriormente.

Visualizamos en el microscopio y delimitamos la estructura y morfologa bacteriana. Se identific las bacterias Gram positivas y Gram Negativas.

resultados

M1 (Mtodo de Estra) Grupo 4

Observacin: Result fallas no se pic bien la muestra.Forma: No se tom bien la muestraColor: No se tom bien la muestra (no cogi el tinte).

M2 (Mtodo de Exposicin al Medio Ambiente) Grupo 4

Observacin: Se observ diplococos y ttradas Forma: cocosColor: Violeta azulado (Gram Positivas)

M3 (Mtodo de Hisopado de Mano Limpia) Grupo 4

Observacin: Se observ bacterias separadas Forma: cocobacilos Color: rosado tenue (Gram Negativas)

M1 (Mtodo de Hisopado de Mano Limpia) Grupo 2

Observacin: Se observ levaduras Forma: levaduriformes Color: morado (Gram Positivas)

M2 (Mtodo de Exposicin al Medio Ambiente) Grupo 2

Observacin: Se observ bacilos Forma: bacilos Color: morado (Gram Positivas)

M1 (Mtodo de Hisopado de Mano sin Lavar) Grupo3

Observacin: Result bacilos Forma: bacilos Color: Morado (Gram Positiva).

M2 (Mtodo de Exposicin al Medio Ambiente) Grupo3

Observacin: Result cocobacilos.Forma: cocobacilos.Color: Rosado Tenue.

M1 (Mtodo de Estra) Grupo1

Observacin: Result bacilos en la muestraForma: bacilosColor: Rosado Tenue (Gram Negativa)

M2 (Mtodo de Exposicin al Medio Ambiente) Grupo1

Observacin: Result staphylococos.Forma: CocosColor: Morado (Gram Positivas).

Cuestionario

1.Por qu en la tincin Gram se utiliza el lugol?En microbiologa se emplea en la tincin de Gram para retener el colorante cristal violeta. El lugol entra en las clulas y forma con el colorante cristal violeta un complejo insoluble en agua.Se utiliza esta disolucin como indicador en la prueba del yodo, que sirve para identificar polisacridos como los almidones, glucgeno y ciertas dextrinas, formando un complejo de inclusin termolbil que se caracteriza por presentar distintos colores segn las ramificaciones que presente la molcula de polisacrido. El lugol no reacciona con azcares simples como la glucosa o la fructosa.2.Cul es el fundamento de la tincin de Gram? Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram Positivas y Gram Negativas.La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos. Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el acido lipoteicoico, y ms en la superficie, el acido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglucano (tambin conocido como murena).Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram Negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior esta hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido.Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram Negativas.La diferencia que se observa en la resistencia a la coloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul violcea. Pero pr el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular mas resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo crista violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul/violcea

Bibliografa_ Pelczar and Chan. 1977. Laboratory Exercises in Microbiology. Fourth edition. Mc Graw-Hill Book Company. Tortora, Funke and Case. Introduccin a la Microbiologa. 9na Edicin 2007. Editorial Mdica Panamericana. Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual de Mtodos Generales (segunda edicin). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela. Pimentel - Per2014

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