Genomic Equivalence

  • Published on
    12-Jul-2015

  • View
    1.214

  • Download
    7

Embed Size (px)

Transcript

  • Oleh :Dian Ida LestariF. Yudha Christianti

    KESEIMBANGAN GENOMIK

  • Rumusan Masalah Keseimbangan Genomik dan Differensial Ekspresi Gen Tingkat Embrio

    Keseimbangan Genomik dan Diferensial Ekspresi Gen Tingkat Molekuler

  • Keseimbangan Genomik

    Pengertian :adalah suatu keadaan di mana semua sel somatik dalam tubuh berisi gen yang sama dan karenanya menciptakan makhluk seutuhnya.

  • Differensial Ekspresi Gen Setiap sel tersusun dari set gen yang sama, namun tidak semua gen di dalam sel berekspresi, sesuai dengan kondisi lingkungan internal dan eksternal sel.Hanya 3-5% saja yang di ekspresikanMisal: 1. Di dalam pankreas, gen mengekspresikan hormon insulin 2. Pada sel darah merah, gen mengekspresikan hemoglobin

  • Keseimbangan Genomik dan Diferensial Ekspresi Gen Tingkat EmbrionalTransdeterminasi MetaplasiaKloning

  • Transdeterminasi Merupakan proses perubahan perkembangan sel-sel imaginal menjadi struktur organ yang lainnya dari determinasi normalnya. Contoh : Imaginal discs pada Drosophila melanogaster normalnya terdeterminasi berkembang menjadi antena, akan tetapi kemudian dapat menghasilkan struktur acak pada kaki lalat/

  • Gambar Perkembangan Normal Imaginal Discs pada Drosophila melanogaster

  • Gambar imaginal discs yang mengalami transdeterminasi

  • METAPLASIA Merupakan penggantian reversible sel-sel yang terdiferensiasi dengan sel-sel terdiferensiasi dewasa lainnya.Perubahan darisatu jenissel yang lain umumnya mungkinmenjadi bagian dariproses pematangannormal ataudisebabkan oleh beberapajenisstimulusyang abnormal.

  • Contoh Pembentukan lensa baru pada Salamander dibentuk dari sel-sel iris dorsal.

  • Metaplasia pada Salamander

  • A micrograph of Barrett's esophagus.Sebuah kondisi di mana lapisan esofagus diubah oleh kontak yang terlalu lama asam lambung.

  • KloningDari Bahasa Yunani - klon, rantingKumpulan turunan suatu individu yang dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi)Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya

  • Contoh Kloning Kloning pada Amfibi

    Kloning pada domba Dolly

    Kloning pada Tikus

    Kloning pada tumbuhan

  • Kloning pada Amfibi

  • Kloning pada Domba Dolly

  • Kloning pada Tikus

  • Kloning Tumbuhan

  • Genomic Equivalence and Differensial gene Expresion;Molecular Investigation

  • Gene cloningTransferring geneDNA and RNA blottingDNA Library The polymerase chain reaction

  • 1. Gene CloningMetode untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon) yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan DNA yang kompleks.

  • Gene CloningKetika keseluruhan DNA dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebutPada kloning gen, hanya gen (DNA) tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon)

  • Tujuan mengklon GenMenentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebutMenganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebutMempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebutMengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaanMerekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.

  • Sumber DNA untuk diklonDNA kromosomcDNA (complementary DNA) yang disintesis menggunakan mRNA sebagai cetakan (template)DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan PCR

  • Bahan / Alat untuk MengklonEnzim endonuklease restriksi Enzim ligaseVektors (biasanya plasmid atau bakteriofage)Inang (Host)Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang

  • Cara Mengklon DNA (1)Isolasi vektor kloning (plasmid bacterial) & DNA sumber genPemotongan DNA sumber gen & vektor kloning menggunakan enzim restriksi yang samaPenyisipan potongan DNA sumber gen ke dalam vektor kloning yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi yang sama; potongan disambung dengan bantuan enzim DNA ligase

  • Cara Mengklon DNA (2)Vektor kloning yang telah tersisipi potongan DNA dimasukkan ke dalam sel inang (transformasi sel inang)Menempatkan sel ke dalam medium dg ampisilin dan X-gal Identifikasi sel pengklon pembawa gen yang dikehendaki

  • DNA LibraryGenom DNA dipotong-potong dengan menggunakan endonukleaseSemua fragmen yg dihasilkan diklon secara random ke dalam vektor plasmidSebagian besar informasi genetik akan berada dalam campuran kultur bakteri.Kultur bakteri, yang masing-masing hanya berisi satu fraksi dari genom yang membawa semua gene tersebut dikenal dengan istilah library

  • Pembuatan DNA Library

  • DNA BlottingSOUTHERN BLOTTINGTeknik ini dikembangkan oleh SOUTHERN (1975)Contoh penggunaan metode ini adalah :Untuk menentukan apakah gen tertentu yang diisolasidari suatu organisme (misal: gen Penisilin asilase dari B.subtilis) terdapat dalam bentuk yang sama dengan yang terdapat dalam organisme lain, misal B. Megaterium

    Teknik lain, seperti :- NORTHERN BLOTTING RNA- WESTERN BLOTTING Protein

  • Tahap-tahapan dalam SOUTHERN BLOTTING

    Isolasi DNA kromosom (mis, B. megaterium) DNA dipotong fragmen-fragmenFragmen dipisahkan dengan elektroforesis (gel agarosa)Fragmen DNA denaturasi (alkali) DNA s.s.Gel agarosa dijiplak pada kertas nitroselulosa Fragmen pada kertas difiksasi (pemanasan 80oC) Kertas direndam dlm larutan yg berisi probe DNA ss*(diberi radioisotop)Jika komplemen DNA probe akan berhibridisasi dg DNA s.s pd kertas nitroselulosa

  • SOUTHERN BLOTTING Cont

    8. Kertas diletakkan pd plat autoradiografi untuk melihatposisi probe yang komplemen9. Dengan membandingkan hasil audiografi terhadap gelagarosa asli maka fragmen mana yg merupakan genpembawa kode untuk enzim penicillin asilase dapatdiketahui dg tepat.10. Selanjutnya fragmen dari gel tsb dapat diisolasi.

    *) misal digunakan DNA probe yang berasal dari gen murni pengkode enzim Penicillin asilase (B. subtillis)

  • PCR (Polymerase Chain Reaction)Adalah suatu teknik / metode dimana setiap fragmen DNA dapat diamplifikasi atau diperbanyak berkali-kali,dengan cepat tanpa menggunakan sel.PCR dapat melipat gandakan DNA milyaran kali dalam beberapa jam. Peristiwa ini harus ada primer karena DNA polimerase akan menambahkan nukleotida hanya pada rantai nukleotida yang sudah ada sebelumnya dengan bantuan primer.

  • Manfaat PCRMemperkuat gen spesifik sebelum diklon.Membuat fragmen Gen DNA secara berlimpahKerjanya sangat spesifik dan ampuh.Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksiDapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami kelainan sebelum dilahirkan.untuk melacak asal usul seseorang dengan membandingkan finger print

  • PCR (Polimerase Chain Reaction)Syarat dalam tabung reaksi terdapat :1. Template (DNA yang telah diketahui urutannya)2. Primer (oligonukleotida, 15-20 pb)Merupakan molekul DNA untai tunggal sintetik yang pendek yang komplemen thd ujung2 DNA target3. Enzim polimerase termostabil4. Prekursor nukleotida

  • Proses PCRDenaturasi DNA ds menjadi DNA ss (94oC, 60)Annealing (55 oC)Sintesis (72 oC)Satu siklus : Dimulai dari denaturasi, annealing sp sintesis 5 menit Proses polimerisasi satu molekul DNA ds menghasilkan 2 copy

  • Perbanyakan DNA dengan PCR (Polymerase Chain Reaction)

  • Transfering Gene Konjugasi TrasformasiTransduksi

  • KonjugasiPerpindahan molekul genetik dari satu sel bakteri ke sel bakteri lainnya secara kontak antar sel.Sel donor akan memberikan informasi genetik kepada resipien.Plasmid akan mengontrol formasi filamen permukaan sel yang dibutuhkan untuk mengadakan kontak pada waktu terjadinya perkawinan.

  • Konjugasi ContPlasmid memiliki sistim khusus untuk replikasi dan transfer DNA plasmid dan sistem pengontrolan Plasmid memiliki faktor F yang merupakan faktor konjugatif ,

  • TransformasiProses perpindahan genetik dimana sel resipien membutuhkan molekul DNA bebas (DNA yang berada diluar sel atau yang telah dimurnikan)Dalam laboratorium transformasi dapat dilakukan dengan mengisolasi DNA donor kemudian menambahkannya pada suspensi sel resipien.Transformasi dapat terjadi secara alami.

  • Transformasi ContPada prinsipnya transformasi akan terjadi bila sel resipien mampu menerima DNA yang telah diisolasi dari sel donor.Transformasi dapat terjadi pada bakteri Gram positif ataupun Gram negatifTransformasi dapat dipindahkan dari sel bakteri kepada sel tanaman.

  • Transduksi Adalah transfer genetik dari sel ke sel oleh virus dari sel inang .Transduksi terbagi 2Tranduksi Khusus : hanya terjadi pada beberapa virus tertentu, gen inang langsung diintegrasi kedalam genom virus,lalu ditransfer ke resipien selama proses lisogenisasi (pembentukan lisogen )Lisogen adalah bakteri yang mengandung faga lengkap

  • Transduksi ContTransduksi umum : gen gen inang yang berasal dari suatu genom akan menjadi bagian dari partikel DNA virus yang sudah matang dari suatu tempat atau penambahan pada genom virus.Virus yang telah mengalami transduksi tidak mampu melisiskan inang. Hal ini disebabkan sel bakteri telah menggantikan tempat penting pada gen virus.

  • *