Tincion de Gram

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    24-Jul-2015

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Universidad Autnoma de QuertaroLicenciatura en microbiologa, Campus Aeropuerto

Reporte de Practica #3:Tincin de microorganismos

Laboratorio de Biodiversidad de los Microorganismos

Profesora: Erika Beatriz lvarez Hidalgo

Equipo #9:Alma Marina Peralta RuizRebeca Alejandra Oloarte PulidoJuana Mara Lpez Martnez

1 de octubre del 2013

INTRODUCCIN

Los microorganismos, son seres vivos muy pequeos que solo pueden verse a travs de un microscopio, por lo que antes de su invencin nadie tena conocimiento de la existencia de microorganismos, dicho esto, la microbiologa naci con el primer microscopio, el cual fue inventado por Antoni van Leeuwenhoek y es el instrumento microbiolgico de mayor importancia.

En la actualidad tenemos diferentes tipos de microscopios que van desde los ms bsicos hasta los ms novedosos y avanzados, stos nos permiten observar cosas tan pequeas como estructuras internas celulares, microorganismos en tercera dimensin, as como su morfologa; todos los microscopios utilizan lentes para aumentar el tamao de los microorganismos o clulas y as hacerlas visibles al ojo humano.

Para poder observar dichos microorganismos existen varios mtodos los cuales dependen del tipo de microscopio que se va a utilizar as como del objetivo de la observacin.

En este caso especfico, nosotros utilizamos un microscopio ptico de campo claro el cual se utiliza para observar clulas a bajos aumentos. El microscopio ptico usa la luz para iluminar las estructuras celulares; las propiedades fsicas de dicha luz determinan la resolucin del microscopio, por lo tanto nuestra resolucin est limitada. Los lmites en la resolucin de un microscopio ptico estn en aproximadamente 0,2 m.

En el microscopio de campo claro las muestras se visualizan gracias a los contrastes diferentes entre las clulas y el campo que las rodea (la luz); estas diferencias se dan por que las clulas absorben o dispersan la luz en diferentes grados.

En nuestra prctica usamos el mtodo de tincin de gram para poder visualizar nuestras clulas. La tincin de gram es un mtodo de contraste en tinte de tipo diferencial, esto quiere decir que requiere de ms de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre varios tipos de clulas bacterianas, una tincin diferencial por lo general consiste en 3 pasos: primero se pone un colorante primario el cual tie a todas las clulas de nuestra muestra, despus sigue una decoloracin que remover el colorante solo de ciertos tipos de clulas, y finalmente se utiliza un colorante de contraste, el cual tie las clulas que se decoloraron pero no tiene efecto sobre las que an tienen el color primario. La tincin de gram es una de las tinciones ms utilizadas en microbiologa, esta tincin se basa en la cantidad de peptidoglicano que se encuentra en las paredes celulares bacterianas.

El fundamento detrs de esta tincin radica en que las bacterias G+ poseen una capa de peptidoglicano y dos clases de cidos teicoicos (polmeros de glicerol o ribitol unidos mediante enlaces fosfodister), uno se encuentra en la parte interna de la pared celular unido a la membrana citoplasmtica y se llama cido lipoteicoico; y el otro se encuentra anclado solamente en el peptidoglicano (murena). En las bacterias G la capa de peptidoglicano es delgada y se encuentra unida a una segunda membrana citoplasmtica exterior, por medio de lipoprotenas, la membrana externa de las G es soluble en solventes orgnicos como el alcohol o la acetona y su capa de peptidoglicano es demasiado delgada para poder retener el tinte de cristal violeta/yodo.OBJETIVO

Aprender a activar y aislar cultivos as como a ejecutar correctamente la tcnica de tincin de gram para la observacin de la morfologa bacteriana y la diferenciacin primaria de microorganismos.Familiarizarse con el uso del microscopio ptico de campo claro.

MATERIALES

Cepas activadas Alcohol acetona Recipiente de plstico rectangular

Porta objetos Safranina Guantes de nitrilo

Solucin salina Pinzas metlicas Microscopio ptico

Cristal violeta Asas calibradas Mechero bunsen

Lugol Varillas de vidrio y manguera de ltex

METODOLOGA

Pasos para realizar la tincin de gram: 1. Realizar frotis2. Fijar3. Agregar Cristal Violeta y dejar por 1 minuto4. Enjuagar5. Agregar Lugol y dejar por 1 minuto6. Enjuagar7. Decolorar con alcohol acetona8. Enjuagar9. Agregar Safranina y dejar por 1 minuto10. Enjuagar11. Observar en el microscopio

Diagrama de flujo para realizar la tincin de gram.

InicioEsterilizar el asa con calorLimpiar el portaobjetos con alcohol o esterilizar con calor.

Prender el mecheroEnjuagarDejar secar Poner la muestra en la gota de solucin salina y realizar frotisTomar muestra de la cepa activaObservar al microscopioAgregar safranina y esperar 1 min. Enjuagar. Dejar secarAgregar cristal violeta y esperar 1 minFinTomar una gota de solucin salina y ponerla en el portaobjetosAgregar lugol y esperar 1 minAgregar alcohol cetona y enjuagar inmediatamente

RESULTADOS

Rebeca

# de coloniaOrigen de la muestraMedio de cultivo provenienteMorfologa microscpicaGramImagen de observacin al microscopio

1NarizAS Agar sangreCocosG +

2NarizAS Agar sangreCocosG +

3TierraAP Agar pseudomonasBacilosG

4TierraAP Agar pseudomonasCocosG +

5Heces fecales de animalEMB Agar eosina azul de metilenoBacilosG

6Agua de tortugaVB Agar verde brillanteCocosG +

7Agua de tortugaAST Agar soya tripticasaBacilosG +

8Agua de tortugaAST Agar soya tripticasaBacilosG +

9NarizABP Agar Baird ParkerCocosG +

Marina

# de coloniaOrigen de la muestraMedio de cultivo provenienteMorfologa microscpicaGramImagen de observacin al microscopio

1GargantaABP Agar Baird ParkerCocosG +

2Agua de tortugaVB Agar verde brillanteBacilosG +

3Agua de tortugaVB Agar verde brillanteBacilosG

4GargantaAS Agar sangreCocosG +

5TierraAP Agar pseudomonasBacilosG

6TierraAP Agar pseudomonasBacilosG +

7Agua de tortugaAST Agar soya tripticasaBacilosG +

8Agua de tortugaAST Agar soya tripticasaBacilosG +

9Agua de tortugaAST Agar soya tripticasaBacilosG +

Juana

# de coloniaOrigen de la muestraMedio de cultivo provenienteMorfologa microscpicaGramImagen de observacin al microscopio

1Heces fecales de animalEMB Agar eosina azul de metilenoBacilos-

2Agua de tortugaVB Agar verde brillanteBacilos -

3Agua de tortugaVB-Agar verde brillanteBacilos -

4GargantaAS Agar sangrecocos+

5Agua de tortugaAST Agar soya tripticasabacilos+

6Agua de tortugaAST Agar soya tripticasabacilos-

7GargantaABP Agar Baird Parkercocos-

8TierraAP Agar pseudomonasbacilos-

9TierraAP-Agar pseudomonascocos+

1. Realizar frotis

2. Fijar

3. Agregar el cristal violeta y dejar durante 1 min

4. Enjuagar

5. Agregar Lugol y dejar durante 1 minuto. Enjuagar

6. Decolorar con alcohol acetona. Enjuagar inmediatamente

7. Agregar safranina y dejar durante 1 minuto. Enjuagar

8. Dejar secar y observar al microscopio(10x)

9. Observar en el microscopio a (40x)

10. Observar en el microscopio (100x)

DISCUSION DE RESULTADOS

En sta prctica nuestro mayor problema fue el no poder aislar los microorganismos correctamente, por esta razn tuvimos que repetir el aislamiento para as poder tomar una muestra de nuestras colonias ya aisladas y por ende obtener un buen frotis. Otro aspecto importante es esterilizar nuestro porta-objetos antes de utilizarlo, as como utilizar el asa correctamente a la hora de hacer el frotis ya que de no hacerlo as, podramos tener nuestras bacterias muy juntas y esto nos imposibilitara el poder identificarlas. Con respecto a la tincin, es muy importante seguir las indicaciones al pie de la letra, ya que de no hacerlo as podramos tener un resultado alterado, por decir algo, podramos dejar el alcohol acetona un poco ms de tiempo y esto hara que nuestra tincin se vuelva ms rosada que morada, afectando nuestro criterio.

CONCLUSIN

La activacin de colonias en agar soya tripticasa ayudo a la rpida proliferacin de colonias, gracias a esto, pudimos realizar la tincin de Gram satisfactoriamente aunque cabe mencionar que an nos falta mucha prctica para obtener una tincin ms limpia. Se aprendi a realizar la tincin de Gram en bacterias as como a observar e identificar su morfologa, cabe mencionar que gracias a la tincin de gram, podemos inferir el tipo de pared celular que tienen nuestras colonias dependiendo de la tincin que hayan agarrado ya sea la del azul violeta o la de safranina. Por ultimo aunque igualmente importante, aprendimos a utilizar correctamente un microscopio y observamos nuestras bacterias.

BIBLIOGRAFA

Biologa de los microorganismos Michael T. Madigan, John Martinko, Jack Parker Editorial PearsonIntro. a la Microbiologa Gerard J. Tortora Editorial Medica Panamericana